罗非鱼皮/鳞胶原蛋白肽加工性能及抗氧化性质比较研究

张玲，李春海，*，区志峰，叶丽君，海金萍，张钟

（1.广东普通高校食品科学创新团队，广东茂名525000；2.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名525000）

胶原蛋白肽是由至少两个氨基酸分子通过肽键连结而成的化合物，是构成蛋白质结构的片段。肽分子的分类主要是根据氨基酸组成和分子量范围所区分的，包括小肽、寡肽、低聚肽（分子量都在180 Da～1 000 Da）和大肽（分子量范围在 1 kDa至 5 kDa），分子量小于1 kDa的肽被称为小分子活性肽[1]。胶原蛋白肽主要存在于动物的皮肤、骨骼和结缔组织中，因其具有良好的加工性能，如具有较好的吸湿性、吸油性、乳化性和起泡性等加工性能[2－3]，被用于多种食品如面包、糕点和化妆品的生产制造如保湿剂、乳化剂和发泡剂。蛋白质经过一系列水解得到的产物主要是肽和氨基酸的混合物，但主要起到抗氧化作用和延缓衰老的是分子量不大和结构简单的肽类，其更容易补充人体缺乏的抗氧化天然活性物质，提高人体的免疫能力，促进脂类和碳水化合物的联合接收和利用，大量研究表明，胶原蛋白肽经过一系列水解以后得到的产物具备抗氧化作用，可开发成天然抗氧化剂[4－5]。

罗非鱼（tilapia）具有杂食性、耐低氧性、繁殖能力强等生物特性，其营养丰富，肉质鲜美，被广大消费者所喜爱，具有较好的发展前景和开拓市场的潜力[6－7]。鱼类加工过程中，鱼皮和鱼鳞等副产物含有丰富的鱼类胶原蛋白或明胶，这些胶原蛋白中蕴含优良的氨基酸和活性肽[8－9]。而罗非鱼的加工还停留在粗加工水平，大量的罗非鱼下脚料如鱼皮、鱼鳞被加工生产成鱼饲料或被丢弃，而被丢弃的部分占罗非鱼下脚料40%以上，造成极大的资源浪费和环境污染。利用鱼类下脚料生产出来的胶原蛋白活性肽，不仅降低对环境的污染，变废为宝，而且使得鱼类产品商品价值倍增，提高罗非鱼加工水平和填补鱼类胶原蛋白肽的空缺[10]。本文以企业提供的5种不同标称分子量的罗非鱼皮和鳞胶原蛋白肽为研究对象，对肽的加工性能及其抗氧化活性进行了系统研究比较，为开展罗非鱼鱼皮和鱼鳞的精深加工产品提供更多的理论依据及技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

标称为1、3、5 kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽和3、5 kDa罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽：由广东百维生物科技有限公司提供。生产过程：利用鱼鳞、鱼皮为原料，通过脱钙、煮胶、脱盐等工艺，利用微生物发酵产生的碱性酶解制备肽，采用纳滤等膜分离技术分级得到不同分子量范围的肽，最后采用喷雾干燥制得各种肽粉。

金龙鱼调和油：北京天宝天利商贸有限公司；三氯乙酸、铁氰化钾、邻苯三酚、三氯化铁：天津市东华化学试剂厂，均为分析纯；30%过氧化氢：广东恒健制药有限公司。

1525高效液相色谱泵、717plus自动进样器、2414示差检测仪：美国Waters公司；722G可见分光光度计：上海同田生物技术有限公司；HR－120分析天平：四川中浪科技有限公司；DNZDS－1组织捣碎机：北京中慧天诚科技有限公司；80－2B离心机：上海安亭科技有限公司；MGC－800BP－2恒温恒湿培养箱：北京亚华顺达科技有限公司；TBE－300高速逆流色谱：上海光学仪器厂。

1.2 罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽分子量的测定

采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）测定5种肽产品分子量。流动相为0.02 mol/L的KH2PO4缓冲溶液，凝胶柱为TSK G－5000PWXLcolumn（7.8 mm×300 mm）和 TSK G－3000PWXLcolumn（7.8 mm×300 mm）串联使用，流速为 0.6 mL/min，waters 2414 示差检测器，柱温35℃。

取己知分子量的细胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 511Da）、杆菌肽（1450Da）、氧化型谷胱甘肽（651Da）及Gly－Gly－Gly（189 Da）作为蛋白和多肽标准品，以流动相为溶剂将其溶解为2 mg/mL的标准溶液，0.45 μm的膜过滤后，用凝胶渗透色谱（GPC）系统进行检验分析，Breeze数据处理软件处理数据，以标准品相对分子质量的对数（logMw）对洗脱体积（V）建立回归方程，即得到标准曲线。将肽样品用流动相溶解，终浓度为 2 mg/mL～3 mg/mL，用 0.45 μm 的膜过滤，进样量10 μL，运行时间 45 min，记录图谱，在 Breeze数据处理软件中用标准曲线对样品进行积分，可得肽的分子量大小及分布[11]。

1.3 罗非鱼胶原蛋白肽的加工性能研究

1.3.1 吸湿性

分别将密封完好不受潮的标称为1、3、5 kDa罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽和3、5 kDa罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽准确称取1.00 g，均匀地平铺在直径9 cm的培养皿中，置于32℃、相对湿度为RH90%的恒温恒湿培养箱中，每4小时称量一次加样品后培养皿总质量，直到加样培养皿总质量不再增加时为止[12]。

对样品的吸湿性进行计算：L=（M2－M1）M

式中：L为吸湿性，g/g；M1为培养皿加样品的最终质量，g；M2为培养皿加样品的最初质量，g；M为胶原蛋白肽取样质量，1.00 g。

1.3.2 吸油性

吸油性是表征蛋白质吸附油脂能力的物理量，一般采取1 g蛋白质吸油性的毫升数来表示[13]。准确量取2 mL的金龙鱼调和油，置于5 mL的离心管中，分别加入0.5 g的罗非鱼胶原蛋白肽，用细玻璃棒搅拌2 min后，静置 30 min后离心（1 000 r/min，25 min），记录游离调和油的体积。

吸油性计算公式：

式中：H为吸油性，mL/g；V为游离油的体积，mL。

1.3.3 乳化性及乳化稳定性

乳化性就是将水和油结合在一起，形成乳化液的能力。

将罗非鱼胶原蛋白肽置于50 mL蒸馏水中（蛋白浓度为2 g/100 mL），调节pH值为7.0，加入50 mL调和油，在组织捣碎机中，以10 000 r/min的速度均质2 min，移入50 mL离心管中，2 000/min离心5 min，根据乳化层高度计算乳化性：

式中：R 为乳化性，%；H1为乳化层高度，cm；H2为总高度，cm。

测定乳化层高度后，将离心管放入50℃水浴保温，每隔1小时测定乳化层高度[14]，则乳化稳定性计算式：

式中：RW为乳化稳定性，%；K1为静置一段时间的乳化层高度，cm；K2为均质后乳化层高度，cm。

1.3.4 起泡性及起泡稳定性

分别将罗非鱼胶原蛋白肽溶解于100 mL蒸馏水中，于pH7.0的条件下，在组织捣碎机中以10 000 r/min的速度均质2 min，均质停止时记录泡沫体积，则起泡性按照下式计算：

式中：Q为起泡性，%；V为均质停止时泡沫体积，mL。

泡沫稳定性是泡沫保持稳定的能力，分别记录均质停止 1、10、30、60、120 min 后残余泡沫的体积，用来表示泡沫稳定性。

以上试验每组样品均做3组平行试验，取均值。

1.4 罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽体外抗氧化活性的测定

在本研究中选取维生素C为对照，罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽质量浓度梯度为 2、4、6、8、10 mg/mL。

1.4.1 还原力的测定

参照文献[15]的方法，在具塞比色管中加入2.5 mL pH 6.6的磷酸缓冲液、具有差别的质量浓度的样品溶液和质量分数为1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀，在50℃水浴反应20 min后迅速冷却，加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液2 mL，加入2.5 mL蒸馏水和质量分数为0.1%的三氯化铁0.5 mL，混匀后室温放置10 min，在700 nm处测定吸光值。

1.4.2 清除O2-·的测定

采用邻苯三酚自氧化法[16]，邻苯三酚在碱性条件下会自动发生氧化，生成的有色中心产物和超氧阴离子自由基O2－·对自氧化有催化作用。在不同质量浓度的样品溶液中，加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.2）缓冲溶液2.8 mL混匀，在25℃水浴10 min后加入3 mmol/L的邻苯三酚溶液（25℃水浴预热）0.1 mL，混匀后迅速在320 nm波长处测定吸光值，每隔30秒在320 nm处读取吸光度值（A），5 min后结束；以去离子水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HCl（pH 8.2）缓冲溶液2.8 mL调零；空白对照管为去离子水。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率v，按下式计算 O2－·清除率。

式中：A0为空白对照吸光度；A为样品吸光度。

1.4.3 清除·OH的测定

参照文献[17]等方法并略有修改。具体方法为：具有差异的质量浓度的样品溶液加入样品管中，然后放置在37℃水浴锅中，迅速加入1.5 mL基质液[60 mmol/L的磷酸盐缓冲盐溶液（pH7.4），含 65 μmol/L 的 H2O2]作为样品对照组，保温1.5 min后立即加入32.4 mmol/L钼酸铵溶液1.5 mL，反应5 min，405 nm处测定吸光度值。为供试液做对照，均以磷酸盐缓冲盐溶液代替基质液做空白，样品管和对照管吸光值与各空白之差分别记为△A样品和△A对照。以质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制曲线。

1.5 数据分析

采用SPSS Statistics 17.0系统分析软件进行方差分析、相关分析。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼鱼鳞和鱼皮胶原蛋白肽分子量检测结果

企业标称分子量为1、3、5 kDa罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽和3、5 kDa罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽的凝胶色谱图见图1。

图1显示，检测器的信号响应较好，保证了分子量测试的准确性，标称分子量为1、3、5 kDa罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽和标称分子量为3、5 kDa罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽的出峰时间基本一致，且均为单峰。其中标称5 kDa鱼皮胶原蛋白肽和5k Da鱼鳞胶原蛋白肽的出峰位置比较靠前，说明其重均分子质量较高；其中1 kDa鱼皮胶原蛋白肽的出峰时间靠后，说明重均分子质量较低。

图1 5种不同标称分子量的罗非鱼肽产品的凝胶色谱图Fig.1 The gel chromatogram of five tilapia peptides with different nominal molecular weight

通过高效凝胶色谱仪对五种胶原蛋白肽进行处理，得出其相对分子质量分布信息，结果列于表1。

表1 罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽的GPC结果参数Table 1 GPC results parameters for tilapia skin and scale collagen peptides

由表1可知，标称分子量为1、3、5 kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽的重均相对分子质量分别为823、1 196、2 753 Da，多分散系数分别为 1.32、1.38、1.29；标称分子量为3、5 kDa的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽的重均相对分子质量分别为1 189、1 926 Da，多分散系数分别为1.41、1.67。其中鱼皮胶原蛋白肽3 kDa色谱峰较尖锐对称。

2.2 罗非鱼胶原蛋白肽加工性能研究

2.2.1 吸湿性

5种罗非鱼胶原蛋白肽产品的吸湿性测定结果见表2。

表2显示，标称5 kDa的鱼鳞肽吸湿性最强，为0.26 g/g，而3种鱼皮肽中标称5 kDa鱼皮肽的吸湿性较强，为0.25 g/g。由此推测，罗非鱼胶原蛋白肽的吸湿性与胶原蛋白肽的分子量大小有关，分子量越大，吸湿性越强；而分子量大小相近时，罗非鱼鱼鳞肽的吸湿性比鱼皮肽的吸湿性要强。

表2 5种肽样品的吸湿性Table 2 Moisture absorption of five samples

2.2.2 吸油性

影响蛋白质产品吸油性的主要因素是产品的种类、来源、粒子的大小、温度和加工方法等。5种罗非鱼胶原蛋白肽产品的吸油性测定结果见表3。

表3 5种样品的吸油性Table 3 Oil absorption of five samples

根据每1克罗非鱼胶原蛋白肽在一定条件下的吸收调和油的体积（mL）来判断吸油能力，吸油性（mL/g）数值越大表示肽的吸油能力越强。从表3测定结果可以看出，标称1 kDa的鱼皮肽吸油能力最好，为2.57 mL/g；标称5 kDa的鱼鳞肽吸油能力最差，为1.87 mL/g。这说明罗非鱼胶原蛋白肽产品的吸油性与其分子量大小密切相关，肽的吸油性随分子量减少而增强，与肽的来源（鱼皮还是鱼鳞）无关。

2.2.3 乳化性及乳化稳定性

5种罗非鱼胶原蛋白肽的乳化性及乳化稳定性测定结果见表4。

表4 5种样品的乳化性及乳化稳定性Table 4 Emulsification and emulsion stability of five samples

乳化性及乳化稳定性受颗粒大小、溶液pH值、加工方法、温度和蛋白质浓度等影响。由表4可知，5种罗非鱼胶原蛋白肽产品均具有一定的乳化性及乳化稳定性，其中标称5 kDa的鱼皮肽和鱼鳞肽的乳化性较强，分别为50.1%和51.8%，乳化稳定性也较好，以标称5 kDa的鱼鳞肽5 h内乳化稳定性最优，这是由于胶原蛋白肽分子量大，利于在油水界面的扩散和吸附。

2.2.4 起泡性与起泡稳定性

5种罗非鱼胶原蛋白肽的起泡性及起泡稳定性测定结果见表5。

表5 5种样品起泡性与起泡稳定性Table 5 Foaming and foaming stability of five samples

表5表明，5种罗非鱼胶原蛋白肽的起泡性相差不大，在165%～170%之间；60 min内，标称为5 kDa的鱼皮肽和鱼鳞肽起泡稳定性均较好。这说明罗非鱼胶原蛋白肽起泡性与分子量大小和肽来源无关，但分子量大的肽起泡稳定性更优。

2.3 罗非鱼胶原蛋白肽的体外抗氧化活性分析

2.3.1 罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽的还原力

图2显示的是5种罗非鱼肽产品的还原力。

由图2可知，在测试质量浓度（20 mg/mL～100 mg/mL）范围内，还原力（y）与具有差异分子量的肽的质量浓度（x，mg/mL）均呈良好的线性关系。其中维生素C、标称 1、3、5 kDa的鱼皮肽还原力（y）与质量浓度（x）的回归方程分别为y=0.009 5x+0.256 3（R2=0.998 6），y=0.001 3x+0.052 1（R2=0.999 0），y=0.000 7x+0.000 2（R2=0.998 9），y=0.000 5x-0.003 8（R2=0.998 2）；标称 3 kDa和5 kDa的鱼鳞肽还原力（y）与质量浓度（x）的回归方程分别为：y=0.000 6x+0.017 1（R2=0.999 1），y=0.000 4x+0.007 2（R2=0.999 4）。

图2 罗非鱼鱼皮与鱼鳞胶原蛋白的还原力Fig.2 The reducing power of tilapia skin and scale collagen peptides

研究发现，被测样品的还原能力与它所表现的抗氧化活性密切相关。抗氧化物质能够供给电子把铁氰化钾中Fe3+还原成Fe2+，Fe2+在700 nm波长处有最大的吸光度，吸光度值越大表明样品具有的还原性越强[16]。

由图2可知，随着质量浓度的增大，维生素C与5种肽产品吸光度都在不断递增，拟合方程说明这些样品的总还原力与其质量浓度均正相关。虽然这几种肽产品的还原力总体都不同等浓度的维生素C弱一些，但也表现出一定的还原力，且标称1 kDa的鱼皮肽还原力相对最强，抗氧化性最好；其次是标称3 kDa的鱼鳞肽和3 kDa的鱼皮肽，最弱的是5 kDa的鱼鳞肽和5 kDa的鱼皮肽。这表明罗非鱼胶原蛋白肽的还原力与肽分子量有明显的关系，而与肽的来源（鱼鳞或鱼皮）关系不大。

一些研究也发现，低分子量蛋白肽抗氧化性更强[18－20]，这可能是因为一些能与氧化物质反应的氨基酸残基由于蛋白质被水解暴露了出来；可能是在油水界面上聚集了一些具有两性性质的短肽，使细胞膜上的脂质不受氧化物质的攻击；也有可能是因为水解使羧基基团和氨基基团的浓度增加，提高了螯合游离金属离子的能力[21]。Alemán等[22]对不同分子量的鱿鱼凝胶蛋白水解产物进行氨基酸组成分析，发现它们之间区别不大，但4组成分的抗氧化性却存在很大区别。任俊凤[23]证明在鱼类当中具有差异的分子量的河豚鱼皮胶原蛋白肽中，分子量越小其总还原力越强，而与维生素C作对照品得出的结果跟本测试相似，其还原能力远远弱于维生素C。

2.3.2 罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽对O2－·的清除作用

自由基与机体内许多生理疾病有着密不可分的联系，体内过多的氧化自由基与蛋白质、氨基酸发生反应，造成身体疾病。抗氧化胶原蛋白肽会与自由基发生反应，阻断自身的氨基酸、蛋白质和自由基发生反应。O2－·是生物体内发生生化反应产生的具有强氧化能力的自由基，以清除O2－·能力来表征样品的抗氧化能力。

图3显示的5种罗非鱼胶原蛋白肽产品对O2－·的清除作用效果。

图3 罗非鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽对O2－·的清除作用Fig.3 The scavenging effect of tilapia skin and scale collagen peptides on O2－·

邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化过程的链式反应，在自氧化过程中生成O2－·能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在停滞30 s～45 s后与时间呈良好的线性关系，一般维持4 min，随后减慢[24]。

图3显示，5种罗非鱼胶原蛋白肽产品的O2－·的清除能力也均比同等质量浓度的维生素C显弱，但标称5 kDa罗非鱼鱼鳞肽O2－·的清除能力比维生素C效果稍微弱一些，是5种产品中效果最佳的，其次是标称5 kDa鱼皮肽、3 kDa的鱼鳞肽、3 kDa的鱼皮肽，而标称为1 kDa的鱼皮肽能力最弱。可见，肽产品分子量影响其O2－·清除能力，且分子质量越大，能力越强；肽产品O2－·清除能力也与肽的质量浓度呈正相。

2.3.3 罗非鱼鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽对·OH的清除作用

生物体内H2O2会很容易裂解·OH，而·OH却是生物需氧代谢过程中生成的具有强氧化能力的带氧自由基。生物体内却没有清除·OH的物质，因此探究通过清除H2O2来避免·OH的产生的试验，具有非常重要的价值[25]。

图4 罗非鱼皮和鱼鳞胶原蛋白肽对·OH的清除作用Fig.4 The scavenging effect of tilapia skin and scale collagen peptides on·OH

图4显示的是5种罗非鱼胶原蛋白肽产品的·OH清除能力。由图4可知，标称5 kDa鱼鳞肽清除·OH的能力明显优于同等质量浓度维生素C的能力，标称3kDa鱼鳞肽清除·OH的能力则与维生素C相当；标称为5 kDa的鱼皮肽清除·OH的能力略弱于维生素C，另外两种鱼皮肽清除·OH的能力更弱一些。这说明鱼鳞肽的·OH清除能力普遍优于鱼皮肽；且分子量越大，能力越强；清除能力也与样品质量浓度正相关。可见罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽是一种较好的·OH的清除剂。

3 结论

本试验对企业提供的标称分子量为1、3、5 kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽和3、5 kDa罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽的实际分子量、加工特性（吸湿性、吸油性、乳化性、起泡性等）、体外抗氧化能力进行了较为系统地研究。结果表明，5种肽产品的标称分子量与实际分子量均有一定的差异；肽产品的吸湿性主要与肽分子质量有关，分子量越大，吸湿性越大；其中标称为5 kDa的鱼鳞肽吸湿性最强，为0.26 g/g。吸油性也与肽分子质量有关，分子量越小，吸油性越强，其中标称为1 kDa的鱼皮肽吸油性最强，为2.57 mL/g；乳化性则随着分子质量增加而增强，标称为5 kDa的鱼鳞肽乳化性最强，达到51.8%，5 h内乳化稳定性最优；5种产品的起泡性很接近，在165%～170%之间，60 min内，标称5 kDa的鱼皮肽和鱼鳞肽起泡稳定性均较好；通过与维生素C做参照对比，探明了5种罗非鱼胶原蛋白肽产品的还原力、O2－·清除效果以及·OH清除效果，发现肽产品3种抗氧化能力均随样品浓度增长而增强，肽产品的还原力和O2－·清除效果略差于维生素C，而标称3 kDa和5 kDa的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽对·OH的清除效果则比维生素C显优，其中5 kDa的鱼鳞肽对·OH的清除效果最高达到84%。

综上所述，这5种罗非鱼胶原蛋白肽具有良好的加工性能，具有一定的抗氧化能力，具有较好的开发应用空间。