不同稳定化方法对麦胚抗氧化活性的影响研究

许蓓蓓　王振涛　黄永军　周建新

[摘要]本研究以还原力、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率为指标，比较不同稳定化方法对麦胚抗氧化活性的影响。结果表明，不同稳定化方法处理麦胚蛋白的抗氧化活性均随质量浓度的提高而增加，同一麦胚蛋白浓度时，还原力和DPPH自由基清除率差别较小，且与未处理后的麦胚蛋白较为接近，超氧阴离子自由基清除率均有降低趋势，且低于未处理麦胚蛋白。麦胚蛋白酶解有助于提高抗氧化活性。

[关键词]稳定化方法；麦胚；抗氧化活性

中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180309

麦胚是面粉生产过程中的主要副产物之一，具有高达30%的蛋白质含量，而且麦胚蛋白是一种全价蛋白，能满足人体所必需的8种氨基酸，还蕴含着许多具有生理活性的氨基酸序列。目前，脱脂麦胚的抗氧化活性已被很多研究证实，Adom等研究了麦粒各部分的体外抗氧化活性，结果表明麦胚抗氧化活性明显强于麦粒的其他部分。Zhu等研究发现，相对分子质量在1500以下的麦胚蛋白水解物显示的各种体外抗氧化活性指标均较高。麦胚中具有抗氧化活性作用的主要是肌肽和谷胱甘肽，以及蛋白质被酶解之后获得的抗氧化肽。麦胚的抗氧化性提取物可以作为某些功能食品的基料，或者直接食用，起到增强人体免疫力、延缓机体衰老、减少一些自由基对机体损伤的作用。目前已被证实具有抗氧化活性的天然肽大多都是通过酶解蛋白质获得的，水解脱脂蛋白能显著提高麦胚的抗氧化活性。

本研究通过测定还原力、DPPH自由基清除率、超氧陰离子自由基清除率等指标，比较酶解前后，不同稳定化方法处理麦胚水解物的抗氧化活性。

1材料与方法

1.1材料与试剂

小麦胚：淮安市新象面粉有限公司；福临门一级大豆油：中粮集团；氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、SDS、正己烷等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

JR-Y10臭氧灭菌箱：南京金仁环保科技有限公司；HG101-2电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂；P70D20TL-D4微波炉：格兰仕微波炉电器有限公司；FW100高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；722光栅分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SYQ-DSX-280B不锈钢压力蒸气灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司；IKAT18高速分散机：北京中联科仪科技有限公司；酶标仪：美国Bio Tek公司。

1.3麦胚稳定化处理方法

烘烤处理：料层厚1～2em，110℃烘干30min，待温度自然降到室温后用聚乙烯自封袋包装；微波处理：料层厚1～2em，600W处理2min，待温度自然降到室温后用聚乙烯自封袋包装；高压蒸汽处理：料层厚1～2em，0.1MPa处理20min，冷风干燥20min；臭氧处理：双层纱布包装麦胚置于臭氧灭菌箱的滚筒内，80mg/mL处理15min，取出，用聚乙烯自封袋包装。

1.4脱脂麦胚蛋白的制备

稳定化处理后的麦胚用80%乙醇清洗，45℃烘干12h，置于锥形瓶中，按1：5（M/V）的比例加入正己烷，恒温振荡箱浸泡12h，倒掉上清液，再按1：3（M/V）的比例加入正己烷，恒温振荡箱浸泡12h，倒掉上清液，低温烘干，获得脱脂麦胚。粉碎，全部过80目筛，将细化的样品按料水比为1：20（g/mL）搅拌均匀，用0.5mol/L的NaOH溶液将pH值调至9.0，搅拌浸提30min，浸提液3 500dmin离心20min，取上清液，然后用1.0mol/L的HCl溶液将上清液的pH值调至6.3，加入适量的淀粉酶，并置于60℃的水浴锅中，酶解至遇碘不呈蓝色为止，将溶液pH值调为4.0，然后离心去上清液，冷冻干燥得脱脂麦胚蛋白。

1.5脱脂麦胚蛋白的酶解

利用碱性蛋白酶在50%、pH8.0、加酶量6.0%、底物浓度4.0%的条件下进行酶解3h，沸水浴灭酶10min，冷却后冷冻干燥备用。

1.6还原力的测定

取冷冻干燥后的脱脂麦胚蛋白，配制质量浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL、lO.Omg/mL的脱脂麦胚蛋白液，取0.8mL各浓度液，分别加入1.6mI&2mol/L（pH6.6）的磷酸盐缓冲液，2.0mL1%的铁氰化钾溶液，混合后于50℃恒温水浴中反应20min，取出冷却，再加入2.0mL10g/mL的三氯乙酸溶液，混合均匀后3 500r/min离心10min，取2.0mL上清液，并加入2.0mL蒸馏水和0.4mL0.1g/mL的三氯化铁溶液，混合均匀，室温静置30min，在波长700nm处测定吸光度A，以相同质量浓度的V_C做对照实验。

1.7DPPH自由基清除率的测定

取冷冻干燥后的脱脂麦胚蛋白，配制质量浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL的梯度液，取ZOnaL，加入2.0mL1.0×10^-4md/L的DPPH自由基无水乙醇溶液，混合均匀，室温下避光反应20min，取出，4 000r/min离心10min，取上清液在波长517nm处测定吸光度A_i，以2.0mL样品和2.0mL无水乙醇溶液，测定其吸光度A_j，以相同质量浓度的V_C做对照实验。DPPH自由基清除率计算见公式（1）。

（1）

式中，A₀为未加样品的DPPH自由基的吸光度；A_i为加样品后的DPPH自由基的吸光度；A_j为样品与无水乙醇混合后的吸光度。

1.8超氧阴离子自由基（O₂^-）清除率

取干燥洁净的试管，向试管中依次加入1.0mLO.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，1.0mL0.001mol/L的EDTA溶液，再加入0.4mL质量浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.Omg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL的脱脂麦胚蛋白液以及1.0mL0.000 4mol/L的邻苯三酚溶液，混合均匀后，静置反应10min，再加入30μL0.1mol/L的二硫苏糖醇溶液终止反应，测定溶液在波长325nm处的吸光度A，以相同质量浓度的V_C做对照实验，样品对O₂^-的清除能力，见公式（2）。

（2）

式中，An为邻苯三酚与溶剂混合液的吸光度；A₁为邻苯三酚与样品反应的吸光度；A₂为样品与溶剂混合液的吸光度。

1.9数据处理

数据为三次平行试验的平均值，测定结果用EXCEL作图，并进行回归分析。

2结果与分析

2.1稳定化处理后脱脂麦胚蛋白酶解前抗氧化活性分析

2.1.1还原力

抗氧化剂是通过自身的还原作用来清除自由基，抗氧化活性正相关于还原力，700nm波长处吸光度的高低可以间接反映抗氧化剂的抗氧化活性，吸光度越大，还原力越强，说明抗氧化活性越高。由图1可知，麦胚蛋白在酶解前，麦胚还原力随蛋白浓度增加而升高，但是还原力水平较低，不同稳定化处理麦胚蛋白的吸光度值相差很小，说明不同处理方法对未酶解麦胚蛋白的还原力影响较小。

2.1.2DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率是抗氧化性的一种反映，清除率越高，说明抗氧化活性越强。由图2可知，V _C具有很高的DPPH自由基清除率，当质量浓度为10mg/mL时达到了93.86%，不同稳定化处理的麦胚蛋白的清除率不同，但其DPPH清除率均随蛋白浓度的增加而升高，在低浓度时，不同处理麦胚蛋白的清除率比较接近，随着蛋白浓度的增大增加较快，当质量浓度为10mg，mL时，均能达到60%左右，当质量浓度为5.0mg/mL时，微波和臭氧处理后的麦胚显示了较好的DPPH清除率，其清除率均高于未处理麦胚，反映在此浓度时其处理下的麦胚蛋白具有较高的抗氧化活性。

2.1.3超氧阴离子自由基（O₂^-）清除率

脂质过氧化过程是一个产生自由基和自由基参与的链式反应过程，超氧阴离子自由基对细胞损伤的一个重要方面就是使细胞的膜相系统发生过氧化，对超氧阴离子自由基的清除效果反映了物质的抗氧化能力。由图3可知，当质量浓度为0.1～10mg/mL时，V_C和不同穩定化处理的麦胚蛋白水解

图2不同稳定化处理后麦胚蛋白酶解前的DPPH清除率物对自由基清除率不同，且随着蛋白浓度的增加而不断升高。当质量浓度为10mg/mL时，V_c对O₂^-的清除率达到98.3 1%，未处理麦胚蛋白在此时显示出较高的清除率，高于臭氧处理和不同热处理下的麦胚蛋白的O₂^-清除率，说明经过不同处理后的麦胚蛋白超氧阴离子自由基清除率反映的抗氧化活性均有所降低。

2.2稳定化处理后脱脂麦胚蛋白酶解后抗氧化活性分析

2.2.1还原力

不同稳定化方法处理后，脱脂麦胚蛋白酶解后的还原力如图4所示。由图4可知，当质量浓度为0.1～10mg/mL时，不同处理后的酶解麦胚蛋白的还原力先缓慢增加后逐渐增大，但远低于V_C。在低浓度时，臭氧和微波处理后的麦胚蛋白的还原力与未处理麦胚相差较小，随着麦胚蛋白浓度的增加，未处理和臭氧处理的麦胚蛋白的还原力增加较高，高于微波处理的麦胚蛋白，说明臭氧处理对麦胚蛋白的还原力影响较小。

2.2.2DPPH自由基清除率

不同稳定化处理后脱脂麦胚酶解后的DPPH自由基清除率如图5所示。当质量浓度为0.1～10mg/mL时，V_C和不同方法处理的麦胚蛋白水解物对DPPH的清除率均随质量浓度的增大而逐渐增大，但不同处理麦胚蛋白水解物变化过程有所不同。臭氧处理麦胚蛋白水解物清除率变化趋势与未处理麦胚蛋白较为相似，当质量浓度为5mg/mL时趋于平缓，分别达到84.48%、84.89%。微波处理麦胚蛋白水解物清除率则在1.0mg/mL后趋于平缓，当质量浓度为1.0mg/mL时，其清除率已达到81.87%，当质量浓度为10mg/mL时，V_C、未处理麦胚水解物、臭氧处理麦胚水解物、微波处理麦胚水解物对DPPH自由基的清除率分别达到93.86%、84.89%、84.16%、82.74%，说明不同处理对麦胚DPPH自由基清除率影响差别不大。

2.2.3超氧阴离子自由基（O₂^-）清除率

麦胚蛋白水解物对超氧阴离子自由基的清除率如图6所示。可以看出，当质量浓度在0.1～10mg/mE时，V_C以及不同处理的麦胚蛋白水解物对O₂^-的清除率均随质量浓度的增大而逐渐增大，但不同处理麦胚蛋白水解物变化过程有所不同。当质量浓度低于1.0mg/mL时，微波处理麦胚蛋白的水解物的清除率与未处理麦胚蛋白较为接近，臭氧处理麦胚蛋白水解物的清除率均低于未处理和微波处理的麦胚蛋白水解物。当质量浓度为10mg/mL时，V_C、未处理麦胚水解物、微波处理麦胚水解物、臭氧处理麦胚水解物对超氧阴离子自由基的清除率分别达到88.31%、63.56%、52.99%、48.85%。

3结论

以还原力、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率为指标，比较不同稳定化方法处理后麦胚的抗氧化活性。研究表明，酶解后麦胚的抗氧化活性明显高于酶解之前，不同稳定化方法处理麦胚的抗氧化活性变化趋势基本一致，均随质量浓度的增加而不断增加。同一麦胚蛋白浓度时，其还原力和DPPH自由基清除率差别较小，且与未处理麦胚较为接近，超氧阴离子自由基清除率均有降低趋势，且低于未处理麦胚，说明以还原力和DPPH自由基清除率表现的抗氧化活性受不同稳定化方法的影响较小，超氧阴离子自由基清除率表现的抗氧化活性受不同处理方法影响较大。通过比较不同稳定化方法下麦胚抗氧化活性指标，明确了不同稳定化方法对麦胚抗氧化活性的影响，对麦胚蛋白开发利用时选择合适的处理方法提供依据。