蛋白酶种类及水解时间对猪血浆蛋白水解物抗氧化性和乳化性的影响

摘 要：主要探讨蛋白酶种类及水解时间对猪血浆蛋白水解物抗氧化活性以及乳化能力的影响。采用3种蛋白酶（碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶）对猪血浆蛋白分别水解20、40、60、80、120 min。测定猪血浆蛋白水解物的抗氧化活性、乳化活力、乳化稳定性以及分子质量的变化趋势。结果表明：相对于木瓜蛋白酶和中性蛋白酶来说，碱性蛋白酶能够显著提高猪血浆蛋白水解物的还原能力、ABTS+·和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力（P<0.05），而且碱性蛋白酶水解60 min时所获得的猪血浆蛋白水解物具有最高的乳化活力和乳化稳定性（P<0.05）。另外，随着水解时间的延长，猪血浆蛋白水解物中小于5 kD的成分显著增加（P<0.05），且碱性蛋白酶对猪血浆蛋白的酶解效果最佳（P<0.05）。上述结果表明，碱性蛋白酶适度水解猪血浆蛋白以后获得的水解物同时具有良好的抗氧化活性和乳化能力。

关键词：猪血浆蛋白；水解物；抗氧化活性；乳化特性；适度水解

Abstract： The effect of different hydrolysis times and type of protease on the antioxidant activity and emulsifying activity of porcine plasma protein hydrolysates （PPPH） was investigated. Porcine plasma protein was hydrolyzed with three different commercial proteases （alcalase， neutral protease and papain） for 0 to 120 min. The antioxidant activity， emulsifying activity index （EAI）， emulsion stability index （ESI） and molecular weight distribution of the hydrolysates were evaluated. The results showed that compared with neutral protease and papain， the PPPH prepared with alcalase rendered the highest antioxidant activity （reducing power， ABTS+· radical-scavenging activity and DPPH radical-scavenging activity） （P < 0.05）. Moreover， the hydrolysate prepared by alcalase hydrolysis for 60 min showed the highest EAI and ESI （P < 0.05）. The proportion of less than 5 kD was significantly increased with increasing hydrolysis time （P < 0.05）， and the alcalase provided the best hydrolysis efficiency （P < 0.05）. Therefore， these results demonstrated that modest hydrolysis by alcalase could yield PPPH with higher antioxidant capacity and emulsifying properties， which can be used as a potential additive in the food industry.

Key words： porcine plasma protein； hydrolysates； antioxidant properties； emulsify properties； moderate hydrolysis

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.12.002

中图分类号：TS251.9 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）12-0007-05

引文格式：

李月， 孔保华， 王超， 等. 蛋白酶种类及水解时间对猪血浆蛋白水解物抗氧化性和乳化性的影响[J]. 肉类研究， 2016， 30（12）： 7-11. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.12.002. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LI Yue， KONG Baohua， WANG Chao， et al. Antioxidant activity and emulsifying properties of porcine plasma protein hydrolysates as influenced by different hydrolysis times and proteases[J]. Meat Research， 2016， 30（12）： 7-11. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.12.002. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

当前，利用不同的动植物蛋白开发功能性多肽已成为一个研究热点。已有大量的研究表明将蛋白质用适当的酶水解后，产生的蛋白水解物具有很好的抗氧化活性。许多蛋白质经过酶解后都会产生具有抗氧化活性的抗氧化肽，已有的研究包括有乳清蛋白[1-3]、玉米蛋白[4]、卵白蛋白[5]、肌肉蛋白[6]、大豆蛋白[7]、马铃薯蛋白[8]以及荞麦蛋白[9]等。但是过度的水解会严重破坏水解物的乳化性质，使蛋白水解物不能广泛地应用到食品加工中。然而，适度酶解的方法能够使蛋白质获得一定的抗氧化活性和较好的乳化性[10]。适度水解的蛋白质相对于未水解蛋白来说，能够在一定程度上改善其自身的乳化活性，主要归因于长肽链灵活可变的构象以及由于水解而暴露出来的疏水核心[11]。

猪血是现代肉业的主要副产品之一，具备资源丰富、价格便宜、吸收利用率高等优点，被认为是一种潜在的营养和功能性蛋白来源。一些研究已经表明，猪血浆蛋白可作为功能性成分的蛋白酶抑制剂和肉、鱼糜制品的填充料，并可被人类安全食用，但过度水解严重破坏了猪血浆蛋白的一些功能特性，使其应用受到了严重限制[12]。因此，生产兼具抗氧化活性和改进功能特性的蛋白水解物具有经济利益和生产意义。本研究以3 种蛋白酶对猪血浆蛋白分别水解20、40、60、80、120 min，测定猪血浆蛋白水解物的抗氧化能力、乳化能力和分子质量的变化趋势，考察酶的种类及水解时间对猪血浆蛋白的不同酶解产物的抗氧化能力和乳化特性的影响，为制备出同时具有高抗氧化活性和高乳化性的猪血浆蛋白水解物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪血浆蛋白粉 黑龙江北大荒肉类有限公司；碱性蛋白酶 丹麦Novozymes公司；中性蛋白酶、木瓜蛋

白酶 北京奥博星生物技术有限责任公司；九三一级大豆色拉油 哈尔滨九三油脂。

十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS） 美国Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 天津市巴斯夫化工有限公司；氢氧化钠、铁氰化钾、盐酸、冰乙酸、乙酸钠、三氯化铁、三氯乙酸、过二硫酸钾、

2，2-联氨-双二胺 哈尔滨市万太生物药品公司。

1.2 仪器与设备

JD500-2电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；

AL-104型精密电子天平、FE20K型pH计 上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅 上海

惊宏实验设备有限公司；JB-2恒温磁力搅拌器 上海雷磁新径仪器有限公司；GL-21M冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TU-1800紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猪血浆蛋白水解物的制备

根据Liu等[13]的方法将加热处理（95 ℃，5 min）的猪血浆蛋白水溶液（4 g/100 mL）分别与3 种蛋白酶作用20、40、60、80、120 min，酶与底物质量比为2∶100，反应过程中不断加入1 mol/L的NaOH，使pH值保持不变。水解结束后95 ℃水浴5 min进行灭酶，然后用1 mol/L

HCl将水解液pH值调至7.0。各水解物以9 000×g离心10 min除去不溶颗粒。

1.3.2 抗氧化性的测定

1.3.2.1 亚铁还原能力的测定

采用Oyaizu等[14]的方法。取0.5 mL的样品，加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH 6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL质量浓度为1 g/100 mL的铁氰化钾溶液，混匀后50 ℃水浴20 min，加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液2.5 mL在3 000×g条件下离心10 min。取2.5 mL的上层清液与2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1 g/100 mL的三氯化铁溶液混匀，反应10 min后，在700 nm波长处测其吸光度。

1.3.2.2 ABTS+·清除能力的测定

采用Ozgen等[15]的方法。ABTS+·工作液的制备：将7 mmol/L ABTS+·储备液与140 mmol/L过硫酸钾（终浓度）混匀。在室温避光条件下放置12～16 h。使用前用20 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.4）稀释至在734 nm波长处吸光度为0.70±0.01。

取3 mL稀释的ABTS+·工作液与100 ?L样品混匀，室温避光反应6 min在734 nm波长处进行比色。

1.3.3.2 分子排阻色谱测定蛋白质的相对分子质量分布

采用吴伟等[18]的方法并作适当修改，将样品稀释到质量浓度1 mg/mL，并过孔径为0.22 μm的滤膜，收集滤液用于相对分子质量分布的测定。使用了Agilent高效液相系统和选择TSK G2000SW柱以及Agilent紫外检测器。流动相为50 mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，流速1 mL/min，压强为0.3 MPa，测定波长为280 nm，柱温为25 ℃。标准蛋白用Marker（分子质量为6 500～200 000 kD）进行校正，并绘制标准曲线。

1.4 数据处理

每个实验重复3 次，结果表示为平均值±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1分析软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 猪血浆蛋白水解物的抗氧化能力

2.1.1 猪血浆蛋白水解物的还原能力

由图1可知，与未水解的猪血浆蛋白相比，3 种蛋白酶水解后的猪血浆蛋白还原能力明显增加（P<0.05）。这是由于水解使肽键断裂增加了氢离子（质子和电子）的可利用性，使水解物获得较强的还原能力[19]。随着时间的延长，水解物的还原能力都表现出先增高后降低的趋势。同时，碱性蛋白酶酶解产物的还原能力要显著高于其他处理组（P<0.05），80 min时酶解产物的还原能力高达0.297。这是由于碱性蛋白酶作为一种内肽酶主要切割多肽链内部的肽键，从而产生具有抗氧化活性的小肽或多肽。研究结果与马艳芳等[20]研究的螺旋藻水解物的还原能力与水解时间的关系的变化趋势相一致，即还原能力随着水解时间的增加而增大，但达到最大值后，再提高水解时间，还原能力反而降低[21]。这说明生产抗氧化性肽时，应根据蛋白质原料的种类，控制不同的水解时间，以获得最大还原能力。

2.1.2 猪血浆蛋白水解物的清除ABTS+·能力

由图2可知，碱性蛋白酶的酶解产物ABTS+·清除能力分别为51.7%、53.4%、57.1%、59.1%和53.6%，均显著高于其他处理组（P<0.05）。已有研究发现与其他蛋白酶相比，碱性蛋白酶水解后的产物具有更强的自由基清除能力[22-23]。

DPPH自由基可以通过接受电子成为相对稳定的抗磁性分子。酶法水解使猪血浆蛋白的结构破坏产生未折叠的蛋白质，暴露的氨基酸残基的电子供体可以与自由基反应，将其转化为更稳定的产品并终止自由基链式反应。

由图3可知，经过3 种蛋白酶水解的猪血浆蛋白与没有经过水解的蛋白相比，DPPH自由基清除能力都有较为明显的提高（P<0.05），并呈现先升后降的变化趋势。这是由于水解改变了蛋白质的结构，分解成了多肽或游离的氨基酸，使其具有了一定的抗氧化活性[24]。通过比较各处理组发现，碱性蛋白酶酶解80 min的产物显示出了相对高的自由基清除能力。可见蛋白酶种类及水解时间能够在一定程度上影响水解物对自由基的清除活性[25]。

2.2 不同酶及水解时间对猪血浆蛋白水解物乳化性质的影响

在乳化体系中，EAI和ESI能够充分反映蛋白质的乳化性能[26]。由表1～2可知，水解后的猪血浆蛋白EAI呈现出先增高后降低的变化趋势，这是由于小肽虽然能迅速扩散到界面上，但由于电荷斥力的作用可能不容易结块产生脂肪球膜，因此不能稳定乳状液，进而导致EAI的降低[19]。碱性蛋白酶水解产物的乳化能力显著高于其他2 个处理组（P<0.05）。水解前的加热处理能够使蛋白质结构轻微展开，水解所产生的一些大分子物质能够更好地吸附于油-水界面，从而降低油水两相的界面张力，致使EAI有所提高[27]。而水解肽段含量的增多有助于提高乳状液的ESI。这与Cheng等[28]研究马铃薯蛋白水解物乳化性的结果具有一致性，即随着水解时间的延长，小肽的数量增多，水解物的乳化性和乳化稳定性越低。与未水解的猪血浆蛋白相比，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解的猪血浆蛋白EAI、ESI却有所降低，这是可能是因为蛋白水解后分子质量降低、表面电荷增加，低分子质量的肽使乳状液中的双亲性降低，在一定程度破坏了蛋白的乳化性[29]。因此，对比3 种蛋白酶水解猪血浆蛋白的乳化性质，碱性蛋白酶在水解60 min时具有相对较好的乳化活性和乳化稳定性。

2.3 蛋白质的相对分子质量分布

分子排阻色谱根据蛋白质分子大小来分离不同分子质量物质的混合物，并依据样品洗脱时间划分其分离部分的分子质量分布。通过分子质量排布表可以进一步解释猪血浆蛋白酶解后乳化性质和抗氧化活性趋势变化的原因。依照保留时间和峰面积的大小进而将样品图谱划分为以下4 个区域，分别为：区域Ⅰ（>50 kD）、区域Ⅱ（50～10 kD）、区域Ⅲ（10～5 kD）、区域Ⅳ（<5 kD）。

由表3可知，对比水解前后的猪血浆蛋白，大分子蛋白含量总体呈下降趋势，小分子蛋白含量显著增加

（P<0.05），生成的小分子主要是集中在区域Ⅱ内，说明酶解的过程中大分子的蛋白被进一步水解成了小肽或氨基酸。其中，碱性蛋白酶酶解的变化趋势最为显著。碱性蛋白酶显示出大于50 kD的蛋白含量呈现先增加后减少的趋势，在60 min时峰面积最大，这说明水解的过程中既有多肽链断裂同时还发生蛋白质的聚集[30]，大分子肽或者水解肽段的含量多有助于提高乳化稳定性[31]，这与碱性蛋白酶酶解后乳化性变化趋势一致；小于5 kD和10～5 kD的分子呈现逐渐增加的趋势，小分子蛋白含量的增多，对抗氧化性起到主要作用。

3 结 论

通过对猪血浆蛋白多肽性质的进一步研究和分析，结果显示，与木瓜蛋白酶和中性蛋白酶相比，碱性蛋白酶能显著提高猪血浆蛋白水解物的抗氧化活性，并且碱性蛋白酶酶解60 min的产物具有最高的乳化特性。通过分子排阻色谱能够进一步解释猪血浆蛋白水解物抗氧化能力和乳化活性的变化趋势的原因。因此，通过碱性蛋白酶适度酶解可以获得既具有较高乳化性质又具有一定抗氧化能力的猪血浆蛋白水解物。经过进一步研究，猪血浆蛋白水解物具有作为天然抗氧化剂及用于食品乳化体系中的潜力。

参考文献：

[1] KONG B， PENG X， XIONG Y L， et al. Protection of lung fibroblast MRC-5 cells against hydrogen peroxide-induced oxidative damage by 0.1-2.8 kDa antioxidative peptides isolated from whey protein hydrolysate[J]. Food Chemistry， 2012， 135（2）： 540-547.

[2] PE?A-RAMOS E A， XIONG Y L， ARTEAGA G E. Fractionation and characterisation for antioxidant activity of hydrolysed whey protein[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2004， 84（14）： 1908-1918.

[3] PENG X， XIONG Y L， KONG B H. Antioxidant activity of peptide fractions from whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance[J]. Food Chemistry， 2009， 113（1）： 196-201. DOI：10.1016/j.foodchem.2008.07.068.

[4] JIN D X， LIU X L， ZHENG X Q， et al. Preparation of antioxidative corn protein hydrolysates， purification and evaluation of three novel corn antioxidant peptides[J]. Food Chemistry， 2016， 204： 427-436. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.02.119.

[5] SAKANAKA S， TACHIBANA Y. Active oxygen scavenging activity of egg-yolk protein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates[J]. Food Chemistry， 2006， 95（2）： 243-249. DOI：10.1016/j.foodchem.2004.11.056.

[6] SAIGA A， TANABE S， NISHIMURA T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（12）： 3661-3667. DOI：10.1021/jf021156g.

[7] SINGH B P， VIJ S， HATI S. Functional significance of bioactive peptides derived from soybean[J]. Peptides， 2014， 54（2）： 171-179. DOI：10.1016/j.peptides.2014.01.022.

[8] WANG L， XIONG Y L. Inhibition of lipid oxidation in cooked beef patties by hydrolyzed potato protein is related to its reducing and radical scavenging ability[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（23）： 9186-9192. DOI：10.1021/jf051213g.

[9] MA Y， XIONG Y L， ZHAI J， et al. Fractionation and evaluation of radical scavenging peptides from in vitro， digests of buckwheat protein[J]. Food Chemistry， 2010， 118（3）： 582-588. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.05.024.

[10] XU X， LIU W， LIU C， et al. Effect of limited enzymatic hydrolysis on structure and emulsifying properties of rice glutelin[J]. Food Hydrocolloids， 2016， 61： 251-260. DOI：10.1016/j.foodhyd.2016.05.023.

[11] ADJONU R， TORLEY P， AGBOOLA S. Whey protein peptides as components of nanoemulsions： a review of emulsifying and biological functionalities[J]. Journal of Food Engineering， 2014， 122（1）： 15-27. DOI：10.1016/j.jfoodeng.2013.08.034.

[12] TSOU M J， LIN S B， CHAO C H， et al. Enhancing the lipolysis-stimulating activity of soy protein using limited hydrolysis with flavourzyme and ultrafiltration[J]. Food Chemistry， 2012， 134（3）： 1564-1570. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.03.093.

[13] LIU Q， KONG B H， JIANG L Z， et al. Free radical scavenging activity of porcine plasma protein hydrolysates determined by electron spin resonance spectrometer[J]. LWT-Food Science and Technology， 2009， 42（5）： 956-962. DOI：10.1016/j.lwt.2008.12.007.

[14] OYAIZU M. Studies on products of browning reaction： antioxidative activity of products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Journal of Nutrition， 1986， 44： 307-315. DOI：10.5264/eiyogakuzashi.44.307.

[15] OZGEN M， REESE R N， TULIO A Z， et al. Modified 2，2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid （ABTS） method to measure antioxidant capacity of selected small fruits and comparison to ferric reducing antioxidant power （FRAP） and 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH） methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（4）： 1151-1157.

[16] NOOSHKAM M， MADADLOU A. Maillard conjugation of lactulose with potentially bioactive peptides[J]. Food Chemistry， 2016， 192： 831-836. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.07.094.

[17] PEARCE K N， KINSELLA J E. Emulsifying properties of proteins： evaluation of a turbidimetric technique[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1978， 26： 716-723. DOI：10.1021/jf60217a041.

[18] 吴伟， 林亲录， 华欲飞. 亚油酸氢过氧化物氧化修饰对大豆蛋白热变性和聚集的影响[J]. 油料蛋白， 2011， 6（5）： 16-20.

[19] LIU Q， KONG B H， XIONG Y L， et al. Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis[J]. Food Chemistry， 2010， 118（2）： 403-410. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.05.013.

[20] 马艳芳， 李玉洋， 刘金龙， 等. 水解度对螺旋藻肽乳化性、起泡性及抗氧化性的影响[J]. 食品工业科技， 2016（4）： 196-199； 222.

[21] INTARASIRISAWAT R， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W， et al.

Antioxidative and functional properties of protein hydrolysate from defatted skipjack （Katsuwonous pelamis） roe[J]. Food Chemistry， 2012， 135（4）： 3039-3048. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.06.076.

[22] LI G H， WAN J Z， LE G W， et al. Novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides isolated from alcalase hydrolysate of mung bean protein[J]. Journal of Peptide Science， 2006， 12（8）： 509-514. DOI：10.1002/psc.758.

[23] QIAN Z J， JUNG Q K， KIM S K. Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin， Rana catesbeiana Shaw[J]. Bioresource Technology， 2008， 99（6）： 1690-1698. DOI：10.1016/j.biortech.2007.04.005.

[24] HE R， ALASHI A， MALOMO S A， et al. Antihypertensive and free radical scavenging properties of enzymatic rapeseed protein hydrolysates[J]. Food Chemistry， 2013， 141（1）： 153-159. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.02.087.

[25] ALASHI A M， BLANCHARD C L， MAILER R J， et al. Antioxidant properties of Australian canola meal protein hydrolysates[J]. Food Chemistry， 2014， 146（3）： 500-506. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.09.081.

[26] HUANG S， FRANKEL E N， AESCHBACH R， et al. Partition of selected antioxidants incorn oil-water model systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013， 45（8）： 1991-1994.

[27] JIANG J， CHEN J， XIONG Y L. Structural and emulsifying properties of soy protein isolate subjected to acid and alkaline pH-shifting processes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（16）： 7576-7583. DOI：10.1021/jf901585n.

[28] CHENG Y， XIONG Y L， CHEN J. Antioxidant and emulsifying properties of potato protein hydrolysate in soybean oil-in-water emulsions[J]. Food Chemistry， 2010， 120（2）： 101-108. DOI：10.1016/j.foodchem.2009.09.077.

[29] GUO J Z， LEE H， CHIANG S H， et al. Antioxidant properties of the extracts from different parts of broccoli in Taiwan[J]. Journal of Food and Drug Analysis， 2011， 19（2）： 96-101.

[30] TEMENOUGA V， CHARITIDIS T， AVGIDOU M， et al. Novel emulsifiers as products from internal Maillard reactions in okra hydrocolloid mucilage[J]. Food Hydrocolloids， 2016， 52（Suppl1）： 972-981.

DOI：10.1016/j.foodhyd.2015.08.026.

[31] LI S J， KING A. Structural changes of rabbit myosin subfragment 1 altered by malonaldehyde， a byproduct of lipid oxidation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 47（8）： 3124-3129. DOI：10.1021/jf990028y.