腺病毒介导的hNT-3基因转染对兔前交叉韧带重建术后本体感觉恢复的影响

蔡东高 傅永慧 吕游 曾辉 孙旭

中国医科大学附属盛京医院第四骨科（沈阳 110000）

近些年来，前交叉韧带（anterior cruciate liga⁃ment,ACL）损伤重建术后本体感觉的恢复被广泛重视。前交叉韧带损伤导致的膝关节不稳定，会引起继发性关节炎和半月板损伤，严重影响患者的日常生活和运动功能[1-3]。膝关节稳定性的重建，不仅需要前交叉韧带生物力学的重建，更依赖于术后本体感觉的恢复[4,5]。神经营养素3对传导本体感觉的神经的生长发育和生理功能的发挥起着重要作用[6]，且前交叉韧带重建术后的肌腱移植物内能够检测到神经营养素-3的表达[7,8]，但神经营养素-3与前交叉韧带损伤后本体感觉恢复的关系尚不清楚。因此，本实验通过构建带有人神经营养素-3（human neurotrophin3,NT3）基因的重组腺病毒载体，体内转染给自体半腱肌肌腱移植物，使得hNT-3在肌腱移植物内过表达，而后测量体感诱发电位（somatosensory evoked potential,SEP）、腘绳肌肌电图（electromyography,EMG）的改变和本体感受器数目的变化，旨在探讨神经营养素-3对前交叉韧带损伤重建术后本体感觉的恢复是否有促进作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的日本大耳白兔42只，雌雄不限，体重2～3.1 kg,平均2.62 kg，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。

1.2 主要材料与仪器

重组腺病毒载体（adenovirus-mediated human neurotrophin3,Ad hNT-3）与腺病毒空载体（adenovirusmediated green fluorescent protein,Ad GFP）的构建，腺病毒的包装、浓缩以及滴度的测定均由上海汉恒生物科技有限公司完成，滴度1.26×1011PFU/mL。鼠抗兔S-100单克隆抗体（北京博士德生物技术有限公司），免疫组化试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司），OCT包埋剂（北京中杉金桥生物技术有限公司），石蜡切片机（Thermo，HM340E），冰冻切片机（Thermo，HM525），诱发电位仪（日本光电，MEB2200）,荧光显微镜（Nikon,E800），图像采集软件（NIS-Elements F3.0）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组

42只实验动物随机分成A、B、C三组，每组14只。A组：单侧后肢膝关节前交叉韧带损伤重建术后，自体半腱肌肌腱移植物内用微量注射器多点注射20 μl滴度1.26×1011PFU/mL的Ad hNT-3。B组：单侧膝关节前交叉韧带损伤重建术后，自体半腱肌肌腱移植物内用微量注射器多点注射20 μl Ad GFP。C组：单侧膝关节前交叉韧带损伤重建术后，自体半腱肌肌腱移植物内用微量注射器多点注射20 μl的生理盐水。

1.3.2 动物模型的建立

术前实验动物禁食水12 h，称量体重（kg），以3%戊巴比妥钠溶液（1 ml/kg）耳缘静脉注射进行麻醉，根据观察角膜反射是否消失，适当增减麻醉剂量。用电动剃毛刀剃净术肢膝关节手术区域毛发，以手术切口为中心由内向外用碘伏进行消毒，反复3次，铺无菌洞巾。切开皮肤，采用髌旁内侧入路，切开髌韧带，将髌骨外推暴露出关节腔及前交叉韧带（图1b），用手术刀将前交叉韧带在胫骨和股骨止点处完全切断（图1c）。用钻头直径2 mm的手工钻取胫骨近端内侧和股骨远端外侧髁的骨隧道（图1d、e）。在胫骨结节内上方3～4 cm处切开肌肉表面筋膜，用止血钳分离肌肉组织，暴露分离出半腱肌肌腱。取3 cm长度的半腱肌肌腱（图1a），两端用2-0外科缝合线缝合后牵引通过骨髓道，两端固定于周围骨膜和软组织，使肌腱移植物保持适当的张力（图1f）。前交叉韧带重建后，根据以上分组情况对自体半腱肌肌腱移植物进行微量注射器多点注射（图1g）。用生理盐水配置的青霉素溶液清洗关节腔后，逐层关闭切口。术后不限制实验动物活动，每天给予20万单位的青霉素，持续1周。

1.4 观测指标

1.4.1 一般情况

观察术后实验动物存活状况、饮食状况、关节活动情况以及伤口愈合情况；观察各时间点取材时肌腱移植物两端固定有无松解脱落。

1.4.2 绿色荧光蛋白检测

术后48 h，分别从A、B、C三组中取2只兔，过量麻醉法处死后，取出肌腱移植物，放入4%的多聚甲醛中固定24 h，接着30%的蔗糖溶液沉底，最后放入液氮中保存备用，整个过程要避光。将肌腱从液氮中取出来后，用OCT包埋剂包埋后进行冰冻切片，厚度为7 μm。暗室内，在荧光显微镜蓝光激发下观察绿色荧光蛋白（GFP）。

图1 前交叉韧带重建术

1.4.3 电生理学指标检测

术后8、16、24周，分别从A、B、C 三组中各取4只兔子进行麻醉，角膜反射消失后固定头部和四肢，沿原来的手术切口进入，打开关节腔并暴露半腱肌肌腱移植物。先确定两眶后缘连线与前正中线的交点，由交点向后0.5 cm并旁开0.2 cm作为记录电极点，并于鼻根部皮下放置皮层参考电极，后肢近端用皮下电极接地测定体感诱发电位（SEPs）。然后将记录电极放置于腘绳肌肌腹，参考电极放置于内踝部做肌电图（EMG）检查。双极表面电极刺激肌腱移植物两端胫骨和股骨附着点处，刺激强度 18～20 V。记录并分析SEPs和 EMG潜伏期和波幅。

1.4.4 免疫组织化学染色和HE染色

上述电生理学指标检测后，以过量麻醉法处死动物。取出半腱肌肌腱移植物，放入4%的多聚甲醛中固定24 h。经不同浓度梯度的乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片，切片厚度4 μm。每一个标本进行连续切片，切片后再分别进行HE染色和S-100抗体的免疫组化染色，来观察组织切片的大体形态以及本体感受器的形态和数量。免疫组化大体步骤：石蜡切片脱蜡和水化后，PBS冲洗；柠檬酸钠缓冲液组织抗原修复；阻断内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗，滴加血清，室温孵育；滴加鼠抗兔S-100单克隆抗体，4℃过夜；PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗，室温孵育10分钟；PBS冲洗，滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10分钟；PBS冲洗，DAB显色；苏木素复染，流水反蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料以均数 ±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，使用 K-S检验进行正态性检验，使用 Bartlett检验进行方差齐性检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况

术后A组中1只兔不明原因死亡，给予相应补充。取材时C组中1只兔肌腱移植物股骨端脱落，造模失败，给予相应补充。其他实验动物术后伤口愈合良好，肢体活动正常，取材时肌腱移植物张力良好。

2.2 荧光显微镜观察

转染48 h后，A、B两组中可见大量绿色荧光蛋白表达（图2），C组中未见荧光。

图2 荧光显微镜观察（×20）

2.3 电生理指标检测

A、B、C三组中体感诱发电位和肌电图的潜伏期随着术后恢复时间的延长而缩短，波幅随着术后恢复时间的延长而延长；术后8、16、24周的各个时间点，A组体感诱发电位和肌电图的潜伏期短于B、C两组，波幅高于B、C两组（表1），差异有统计学意义（P＜0.05），而B、C两组比较无明显统计学差异（P＞0.05）。

表1 3组 SEPs及 EMG 潜伏期和波幅变化比较（n=4，±s）

表1 3组 SEPs及 EMG 潜伏期和波幅变化比较（n=4，±s）

注：＊P＜0.05，B、C两组在不同的时间段与A组比较；＃P＜0.05，表示3组内第16 w、24 w与第8 w比较。

组别A组8 w 16 w 24 w B组8 w 16 w 24 w C组8 w 16 w 24 w SEPs EMG潜伏期（ms） 波幅（μV） 潜伏期（ms） 波幅（μV）30.89±1.22 24.93±0.49＃20.69±1.01＃6.48±0.75 8.41±0.49＃12.97±1.16＃19.71±1.25 16.63±0.99＃12.86±1.28＃0.22±0.04 0.25±0.02＃0.34±0.02＃35.37±1.21＊29.09±0.59＊＃25.22±0.97＊＃3.79±0.96＊5.63±0.90＊＃8.31±1.47＊＃25.07±1.28＊21.03±1.42＊＃17.65±1.96＊＃0.12±0.02＊0.17±0.02＊＃0.23±0.02＊＃0.12±0.02＊0.18±0.02＊＃0.24±0.01＊＃34.61±1.39＊29.06±1.76＊＃25.88±0.93＊＃3.94±0.23＊5.76±0.93＊＃8.60±1.37＊＃24.80±1.61＊21.30±0.50＊＃17.47±0.46＊＃

2.4 本体感受器的数目和形态

通过对组织石蜡切片的S-100抗体免疫组织化学染色和HE染色，可见4种形态结构的本体感受器：环层小体、鲁菲尼小体、高尔基样腱器官、游离神经末梢（由于游离神经末梢结构不典型，故在国内外研究中不用于计数，故仅在图中用星形标记了一部分）（图3、图4、图5）。A、B、C三组中本体感受器的数目随着术后恢复时间的延长而增加；且相同的时间点，A组本体感受器的数目多于B、C两组（表2），差异有统计学意义（P＜0.05），而B、C两组本体感受器数目相比较无明显统计学差异（P＞0.05）。

图3 A组免疫组织化学染色（×40）

图4 B组免疫组织化学染色（×40）

表2 3组本体感受器的数目比较（n=4，±s）（不包括游离神经末梢）

表2 3组本体感受器的数目比较（n=4，±s）（不包括游离神经末梢）

＊P＜0.05，B、C两组在不同的时间段与A组比较；＃P＜0.05，表示3组内第16 w、24 w与第8 w比较。

A组B组C组8 w9.25±1.165.25±0.74＊5.75±0.74＊16 w13.25±0.97＃9.5±1.00＊＃9.75±0.97＊＃24 w 18±1.10＃12.25±0.97＊＃12.5±1.34＊＃

图5 C组免疫组织化学染色（×40）

3 讨论

前交叉韧带是维持膝关节稳定的重要结构，除了其生物力学功能外，还有本体感觉功能。当关节受到牵拉刺激，前交叉韧带中的机械感受器会将刺激信号通过相关神经传导通路，经脊髓传导至大脑皮质，大脑分析处理后发出指令调节关节活动[9,10]。Freeman[11]结合之前许多学者对机械感受器的研究，用改良氯化金染色法对ACL中的机械感受器进行了形态学分类：Ⅰ类为 Ruffini小体，呈树状或卵圆形，被膜较薄；Ⅱ类为 Pacinian小体，呈圆形或椭圆形，被膜较厚；Ⅲ类为Golgi样腱器官，呈梭形，被膜较薄；Ⅳ类为游离神经末梢，无髓鞘神经末梢，这种分类方法也是目前公认的分类标准。近年来，有研究者用S-100抗体进行ACL本体感受器的免疫组织化学染色，也能够清晰地观察到本体感受器[12,13]，此方法跟传统的氯化金染色法相比，特异性和敏感性更高。本实验就是采用鼠抗兔S-100单克隆抗体进行免疫组织化学染色，观察到了自体肌腱移植物内4种不同类型的机械感受器：环层小体、鲁菲尼小体、高尔基样腱器官、游离神经末梢，且主要分布在肌腱移植物两端的股骨和胫骨附着点处，这与Zimny[14]等发现的人ACL的感受器主要分布 于ACL的股骨和胫骨附着点处的观点相一致。

由于膝关节运动形式复杂多变 ，本体感觉测量的内容也多种多样，主要有主动或被动角度重现法、阈值测量法、视觉模型法、体感诱发电位和肌电图测量法[15-17]。每种测量方法都有一定的局限性，而SEPs和EMG的测量在动物实验中被广泛应用。本研究中，hNT-3过表达的组别中，SEPs和EMG的潜伏期缩短，波幅升高，提示hNT-3能够促进ACL重建术后本体感觉的恢复。在A、B、C各组中，术后16周的SEPs和EMG的潜伏期短于术后8周但长于术后24周，术后16周的SEPs和EMG的波幅高于术后8周但低于术后24周；术后16周的本体感受器数量多于术后8周但少于术后24周，这表明前交叉韧带重建术后本体感觉的恢复有着很强的时间依赖性，随着术后时间的延长，本体感觉逐渐恢复。

神经营养素是一类参与神经系统生长发育和损伤修复的蛋白质家族，其功能包括促进神经元轴突生长、突触以及髓鞘的形成[18]。Narazaki[19]等的研究表明，神经营养素-3能够促进脊髓损伤修复，改善实验动物的肢体活动；Sterne等[20]发现在大鼠坐骨神经局部应用NT-3可促进坐骨神经损伤的修复再生，说明NT-3对中枢神经系统和外周神经系统都发挥着重要作用。相关研究表明存在肌梭源性NT-3[21]，故外源性NT-3可能有利于建立局部微环境，促进神经纤维的长入和本体感受器的再生过程。腺病毒结构简单，感染率高，易于培养和纯化，且不整合宿主基因组，具有较高的安全性，这些优点使以腺病毒作为载体的基因治疗迅速发展。本实验研究发现，腺病毒介导的hNT-3转染能够促进ACL损伤重建术后移植物内本体感受器的再生和本体感觉的恢复，为临床上前交叉韧带损伤的治疗提供新的思路。

本实验存在的不足：实验动物样本量较少，缺乏足够的说服力；术后观察的时间较短，远期效果有待进一步验证；外源性NT-3促进前交叉韧带重建术后本体感受器再生的机制有待进一步探究；本实验中，腺病毒体内最佳转染滴度有待进一步探究；腺病毒体内转染后的具体表达时间及表达量尚不清楚。