跑台运动对肥胖小鼠骨骼肌CHI3L1表达的影响及其机制

李灵杰 张靓 陈雪飞

北京师范大学体育与运动学院（北京 100875）

几丁质酶-3 样蛋白-1（chitinase 3-like-1，CHI3L1），因其蛋白N末端三个氨基酸分别为酪氨酸（Y）、赖氨酸（K）和亮氨酸（L），分子量为40Kd，因而又称为YLK-40，是1992年在人成骨肉瘤细胞株MG63培养液中发现的一种糖蛋白[1]。体内多种细胞均可合成和分泌CHI3L1，巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞[2]，成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、呼吸道上皮细胞等非免疫细胞[3]及多种肿瘤细胞[4]均有CHI3L1表达。早先研究发现，在肿瘤患者血清CHI3L1水平显著升高，其与肿瘤的恶性度、肿瘤患者的死亡率显著正相关，是肿瘤发生的标记物[5]。近来研究提示，在多种慢性炎症相关的疾病中，血清CHI3L1水平也显著升高，CHI3L1会诱导大量的前炎症因子产生，进而扩大炎症反应，参与多种疾病的发生、发展[6]。多种促炎因子，如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tu⁃mor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleu⁃kin-1β，IL-1β）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）均会诱导CHI3L1的表达。

有研究证实，骨骼肌细胞可以表达、合成和分泌CHI3L1，认为CHI3L1是肌肉因子[7]。运动可以调节CHI3L1的表达，在运动后即刻，人血浆CHI3L1水平及骨骼肌中CHI3L1的表达均显著升高[8]；离体电刺激人原代骨骼肌细胞诱导细胞收缩24小时，骨骼肌细胞中CHI3L1的mRNA表达和蛋白表达均显著升高，培养液中CHI3L1的水平也显著上升，提示运动能够促进CHI3L1的表达、合成和分泌[8]。肥胖时，骨骼肌CHI3L1的表达如何变化，运动对肥胖小鼠骨骼肌CHI3L1的表达影响如何目前还不清楚。本研究以高脂喂养的C57小鼠为肥胖模型，观察8周的跑台训练对比目鱼肌和腓肠肌中CHI3L1表达的影响，并探讨运动调节CHI3L1表达的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

实验动物选用清洁级雄性断乳C57BL/6小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0001。动物分笼饲养，室内温度为22±5oC，湿度为50% ±10%，明暗交替周期为12 h，自由进食和饮水。所有饲料均由沈阳健民动物实验饲料厂提供，按重量计算，普通饲料含有6%的菜籽油和30.5%的小麦淀粉，高脂饲料含有21%的无水黄油和15.5%的小麦淀粉，其他营养成分一致，普通饲料和高脂饲料的可吸收能量分别为16.1和19.4 MJ/kg。CHI3L1抗体购自Abcam公司（Cambridge，UK），实验中所用其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 动物分组与运动模型建立

5周龄健康雄性C57BL/6小鼠32只，体重20.32±0.65 g，随机分成对照组（Con，n=8）和高脂喂养组（n=24），分别进行普通饲料和高脂饲料喂养。8周后，以体重≥对照组平均体重的20%为标准筛选肥胖小鼠16只。高脂喂养肥胖小鼠随机分为高脂安静组（HFD，n=8）和高脂运动组（HE，n=8）。高脂运动组采用跑台运动，前两周进行适应性训练，从10 m/min、20 min/d、5天/周逐渐递增至第2周末的23～25 m/min（相当于85%VO2max）、60 min/d、5天/周，以后的负荷同第2周末负荷，正式训练干预6周[9]。每次训练在下午3点至6点间进行，不使用声、光、电等刺激手段。

1.3 取材

小鼠末次运动结束24 h后，禁食过夜，自由饮水。动物称重后麻醉处死，分离比目鱼肌和腓肠肌的白肌部分进行下述实验。

1.4 免疫组化染色

比目鱼肌与腓肠肌均置于10%的多聚甲醛溶液中浸泡过夜，转至20%蔗糖溶液中浸泡过夜，进行石蜡包埋，用于石蜡切片，切片厚度为5 μm。石蜡切片脱蜡后用于CHI3L1染色。染色流程如下：磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次后，过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗后，PBS浸泡5分钟。经10%山羊血清封闭后冲洗，分别滴加1∶50 CHI3L1一抗、1∶200生物素标记二抗、适量辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液37oC孵育10～30分钟后，PBS冲洗，显色剂显色。CHI3L1特异性染色呈褐色。自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片，观察结果。随机抽取各组动物比目鱼肌和腓肠肌切片（n=3），在400倍视野下随机观察5个视野，确定CHI3L1的表达变化。

1.5 Real-time PCR测定比目鱼肌、腓肠肌中CHI3L1、TNF-α及IL -6的mRNA水平

采用天根动物组织总RNA提取试剂盒（TianGen Biotech，Beijing）提取骨骼肌总RNA，天根逆转录系统（TianGen Biotech，Beijing）进行逆转录。Real-time PCR 反应体积共 20 µl：Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）体系（TransGene Biotech，Beijing）15 ml，10 mmol/L的上下游引物各0.5 ml，cDNA模板5 ml。

GAPDH的上游引物：5’-ACAGCAACAGGGTGGT⁃GGAC-3’；下游引物：5’-TTTGAGGGTGCAGC⁃GAACTT-3’；

CHI3L1的上游引物：5’-GTACAAGCTGGTCTGC⁃TACT-3；下游引物：5’-GTTGGAGGCAATCTCG⁃GAAA-3’；

TNF-α的上游引物：5’-CAGGCGGTGCCTAT⁃GTCTC-3’；下游引物：5’-CGATCACCCC⁃GAAGTTCAGTAG-3’；

IL-6的上游引物：5’-GAGGATACCACTCCCAA⁃CAGACC-3’;下游引物：5’-AAGTGCATCATCGTT⁃GTTCATACA-3’。

所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司（Shanghai，China）合成。进行94oC 30 s，94oC 5 s，60oC 15 s，72oC 10 s，热循环40次。Real-time PCR于ABI 7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosys⁃tems，USA）上进行，以GAPDH作为内参。

1.6 统计方法

实验结果以均数±标准差（±s）表示。数据采用Prism 5.0软件进行单因素方差分析处理，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 跑台运动对高脂喂养的肥胖小鼠体重的影响

高脂喂养16周后，HFD小鼠体重显著高于Con组（P＜0.01，图1），8周的跑台运动显著降低了高脂饮食喂养的小鼠体重（P＜0.01，图1），提示高脂饮食诱导肥胖的发生，运动有效地减轻了小鼠肥胖。

图1 各组小鼠体重比较

2.2 跑台运动对高脂喂养小鼠比目鱼肌、腓肠肌CHI3L1 mRNA表达的影响

与对照组相比，高脂安静组小鼠比目鱼肌和腓肠肌中CHI3L1的mRNA表达均显著上调（P＜0.01，P＜0.001，图2），尤其是腓肠肌CHI3L1表达上升达5倍，提示肥胖时CHI3L1表达改变在快肌更为明显。与高脂安静组相比，高脂运动组小鼠比目鱼肌和腓肠肌中CHI3L1的mRNA表达均显著下调（P＜0.001，图2），比目鱼肌中CHI3L1的表达甚至显著低于对照组（P＜0.01，图2），表明运动明显抑制了CHI3L1的表达。

图2 各组小鼠比目鱼肌、腓肠肌CHI3L1 mRNA相对表达比较

2.3 跑台运动对高脂喂养小鼠比目鱼肌、腓肠肌CHI3L1蛋白水平的影响

在比目鱼肌，HFD小鼠CHI3L1的蛋白表达与Con组相比没有显著改变，HE组小鼠CHI3L1的蛋白表达显著低于HFD 组（图3A）。在腓肠肌，HFD小鼠CHI3L1的蛋白表达显著高于Con组，HE组小鼠CHI3L1的蛋白表达与HFD组相比显著降低（图3B）。免疫组化染色结果提示，除去HFD组大鼠比目鱼肌CHI3L1的蛋白表达没有显著升高，其余CHI3L1的蛋白表达改变与mRNA表达改变一致，在高脂安静组合成增加，而运动能显著抑制其合成。

图3 比目鱼肌和腓肠肌CHI3L1免疫组化的结果

2.4 跑台运动对高脂喂养小鼠比目鱼肌、腓肠肌TNF-α和IL-6表达的影响

炎症因子是诱导CHI3L1表达的主要物质，因此我们测定了骨骼肌局部炎症因子TNF-α和IL-6的表达。高脂安静组小鼠腓肠肌TNF-α和IL-6的mRNA表达均显著上调（P＜0.001，P＜0.01，图4），运动显著降低了炎症因子的表达水平（P＜0.001，P＜0.01，图4）。在比目鱼肌，TNF-α和IL-6的表达虽有变化趋势，但无显著意义（P＞0.05，图4）。

3 讨论

3.1 肥胖时CHI3L1的变化及其病理生理意义

CHI3L1是糖基水解酶18家族（glycosyl hydrolase family 18，GH18）成员之一，CHI3L1的结构在种属间高度保守，提示其有着重要的生物学作用。研究发现CHI3L1具有促进细胞增殖、抑制凋亡、诱导细胞外基质重塑、诱导血管再生及刺激炎症等功能，在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤[10-11]，在动脉粥样硬化、冠心病、高血压等多种心血管疾病[12]，在哮喘、类风湿关节炎、肠道炎症[13]、脑炎等炎症疾病时都发挥其重要的病理生理作用。

近来有大量临床研究报道，在肥胖、糖尿病及其并发症患者血浆中CHI3L1的水平也显著升高。Kyrgios等发现在青春期前的儿童肥胖人群，血清中CHI3L1的水平即显著上调[14]。EI-Mesallamy等报道人血清中CHI3L1的水平与肥胖程度呈正相关，并与血清瘦素水平呈显著正相关[15]。Catalan 等[16]和 Hempen 等[17]分别报道，肥胖人群血液中CHI3L1的水平显著升高，在进行低碳水化合物饮食或胃旁路术后，体重降低的同时血液中CHI3L1的水平也相应降低，提示CHI3L1与肥胖有着密切的联系。

图4 各组小鼠比目鱼肌、腓肠肌TNF-α和IL-6 mRNA相对表达比较

那么，肥胖时升高的CHI3L1的病理生理作用如何呢？Ahangari等[18]用高脂饮食喂养CHI3L1-/-小鼠，发现与野生型小鼠相比，CHI3L1缺失小鼠内脏脂肪显著减少，同时脂肪组织TNF-α、IL-10和IL-6的表达显著减少，提示CHI3L1促进了肥胖时脂质的积聚及脂肪组织炎症因子的合成，进而促进了肥胖的发展。

目前有研究发现，肥胖时，血液中升高的CHI3L1可能来源于外周血单核细胞（Peripheral blood mononu⁃clear cell，PBMC），Catalan等[19]在肥胖人群PBMC发现CHI3L1的mRNA表达升高4倍，PBMC可能是肥胖时血液中CHI3L1的来源之一；此外，脂肪组织，尤其是内脏脂肪可能是肥胖时CHI3L1的另一来源[16]。本研究首次报道了肥胖时骨骼肌中CHI3L1的表达情况，发现高脂饮食诱导快肌纤维为主的腓肠肌中CHI3L1 mRNA表达和蛋白水平显著增加，相较于慢肌纤维为主的比目鱼肌更为明显，提示肥胖时快肌CHI3L1的表达和合成显著增加，考虑到骨骼肌占人体体重的40%，我们推测骨骼肌也可能是肥胖时血液中CHI3L1的来源之一。

3.2 运动对CHI3L1表达的调节

在健康人群，单次25分钟的自行车运动后即刻、1小时和3小时，均不改变血清中CHI3L1的水平[20]。Gorgens等设计了三种运动方式来观察健康人群运动后CHI3L1的变化，分别是70%的最大摄氧量运动60分钟、急性下肢力量练习及12周的有氧和抗阻运动。研究发现急性运动后即刻，血中CHI3L1的水平均显著升高，骨骼肌CHI3L1的mRNA表达在运动后即刻显著上调，运动后2小时回落。12周的运动训练对血中CHI3L1的水平和骨骼肌中CHI3L1的mRNA表达均无影响[8]。Huang等观察肥胖人群进行单次30分钟75%最大摄氧量运动后即刻和运动后1小时，未发现血中CHI3L1水平的改变[21]。综上提示，CHI3L1可能是运动的快反应蛋白，在运动后即刻被显著上调，随后即迅速回落，此外还与运动强度和运动时间密切相关。

本研究首次报道经过8周的跑台训练，肥胖小鼠骨骼肌中CHI3L1的mRNA表达和蛋白水平均显著降低，在比目鱼肌CHI3L1的表达甚至显著低于对照组，提示运动对肥胖时升高的CHI3L1的表达有显著的下调作用，进而减轻了肥胖时CHI3L1的病理生理作用。

3.3 骨骼肌CHI3L1的表达调节

多种促炎因子，如IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ均会诱导CHI3L1的表达。Nielsen等[22]给健康人外源性注射重组IL-6，使血中IL-6水平达到150 ng/ml，24小时后测定发现血中CHI3L1的水平从30 ng/ml升高到57 ng/ml，在注射后48小时回落到正常水平；在人原代培养的软骨细胞，100ng/ml的IL-6孵育24小时，CHI3L1的合成增加40%[23]。在培养的人原代骨骼肌细胞，50 pg/ml的TNF-α处理24小时后，CHI3L1的表达和分泌分别上调6倍和3倍[7]。可见，促炎因子IL-6和TNF-α是CHI3L1表达、合成和分泌的重要诱导因子。

本研究发现肥胖时骨骼肌，尤其是在快肌构成为主的腓肠肌，IL-6和TNF-α的表达显著上调，运动显著抑制了骨骼肌两种促炎因子的表达。推测运动对炎症的抑制作用可能是肥胖时骨骼肌CHI3L1表达降低的主要原因，运动通过抑制炎症间接调节骨骼肌CHI3L1的表达。

4 总结

8周的高脂饮食喂养显著上调了腓肠肌中促炎因子IL-6、TNF-α和CHI3L1的表达，8周的跑台运动显著抑制了促炎因子和CHI3L1的表达，提示运动间接地通过抑制炎症调节骨骼肌CHI3L1的表达，发挥其在改善肥胖及其并发的多种代谢性疾病中的作用。