高糖环境中培养的小鼠心肌微血管内皮细胞蛋白激酶C活性、A激酶锚定蛋白150表达变化

曾超，霍瑞雪，钟磊，曾伟杰，席玉胜，范智文

(1中国人民解放军第四二一医院，广州510318；2空军军医大学唐都医院)

近年来，糖尿病(DM)发病率逐年升高。我国有近一亿DM患者，DM及其并发症严重威胁着人类的健康[1]。冠心病是最严重的DM并发症，已成为导致DM患者死亡的首要原因，但DM导致冠心病的具体发病机制仍不明确[2，3]。研究[4]发现，DM患者心肌微血管内皮损伤早于心肌细胞损伤，DM患者往往伴随着心肌微血管内皮损伤等，而心肌微血管内皮损伤是冠心病发生、发展的基础。蛋白激酶 C (PKC)参与了DM多种并发症过程，尤其是心血管并发症[5]。我们前期试验发现，PKC的异常激活在DM心肌细胞损伤中扮演重要角色。A激酶锚定蛋白150(AKAP150)作为PKA、PKC、蛋白磷酸酶2B(PP2B)的锚定蛋白,在这些激酶的定位、分布及其对底物特异性作用中发挥着重要作用。AKAPs可通过调控PKC的活性状态，促进DM患者的心肌细胞损伤，参与DM心血管并发症的发生、发展[6]。但目前关于心肌微血管内皮细胞中PKC活性变化和AKAP150表达变化相关文章较少。2016年1～12月，我们观察了高糖预处理小鼠心肌微血管内皮细胞PKC活性变化和AKAP150表达变化，并探讨其意义。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物、仪器及试剂 健康雄性C57BL小鼠(8周龄，体质量18～22 g)10只，由空军军医大学实验动物中心提供。恒温细胞孵箱(Thermo Scientific)；超净工作台(苏州精华设备厂)；台式离心机(Thermo)；凝胶电泳及凝胶成像系统(Bio-Rad)；扫描共聚焦显微镜(Olympus)。非放射性PKC活性试剂盒(Promega)；AKAP150抗体(Millipore)；PKC抗体(Millipore)；β-actin抗体(Santa cruz)；辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中杉)。

1.2 心肌微血管内皮细胞的分离培养及高糖干预方法 取10只C57BL小鼠，处死后于无菌条件下取出左心室，置入平皿中，无菌 PBS冲洗左心室组织3次，75%酒精中泡洗15 s。去除左心室组织内外膜，用无菌眼科剪将组织剪碎为约 1 mm3的组织小块。将组织块放置于试管中，加入Ⅱ型胶原酶(浓度为0.2%)3 mL，37 ℃水浴消化6 min。加入3 mL胰酶(浓度为0.25%)，37 ℃水浴消化5 min。加入3 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。100 μm滤网过滤，去滤过液，1000 r/min室温离心10 min。弃上清，向消化后的细胞加入完全培养液(成份为：低糖DMEM培养液，15%胎牛血清，1%链霉素，100 U/L青霉素)，均匀接种到培养瓶中，37 ℃、5% CO2孵箱中培养。细胞培养 6 h后换液，以去除未贴壁细胞，培养瓶中贴壁细胞为心肌微血管内皮细胞，24 h后再次换液，以后每 3 天换液一次，待细胞生长至80%融合后，消化传代(0.25%胰蛋白酶)。取第 2～3代细胞，分为观察组、对照组，分别加入含25、5 mmol/L葡萄糖的培养基。

1.3 心肌微血管内皮细胞PKC活性测定 细胞培养24 h时采用非放射性PKC活性试剂盒检测细胞PKC活性。向DEAE 纤维素柱内加入1 mL PKC抽提液进行预平衡处理。待蛋白匀浆后，将蛋白匀浆液过柱。依次向0.2 mL 小离心管中加入实验试剂，加入样品或PKC，30 ℃ 再孵育30 min。把离心管放入沸水水浴或95 ℃ 加热10 min终止反应。每个样品中加1 μL 80%甘油。把10 μL样品上样到0.8%琼脂糖凝胶孔中,100 V电泳15 min分开样品，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内测算磷酸化PKC与非磷酸化PKC比值，表示PKC的活性水平。参照PKC阳性对照，测量p-PKC、nonp-PKC的光密度(OD值)，PKC活性水平= ODp-PKC/ODnonp-PKC。实验重复3次，取平均值。

1.4 心肌微血管内皮细胞AKAP150蛋白检测 采用Western blotting法。取对数生长期心肌微血管内皮细胞细胞1×107个，细胞裂解液常规提取细胞总蛋白，BCA法定量总蛋白，加入SDS上样缓冲液于提取后的蛋白，煮沸5 min，取50 μg蛋白上样，电泳，转膜，使用 Bio-Rad 湿转膜仪以恒流 300 mA转膜 2 h，待蛋白转至NC膜后，膜于3%BSA封闭液37 ℃封闭1 h，加入一抗 (anti-AKAP150，1∶1 000；anti-β-actin，1∶1 000) 中4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h。ECL发光液显色，Bio-Rad凝胶成像系统成像Western blotting产物电泳条带，Image-J软件测量条带灰度值。以条带的灰度值与β-actin灰度值之比代表目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 心肌微血管内皮细胞PKC、AKAP150结合情况观察 采用免疫荧光共定位法。取两组原代心肌细胞，接种在1×1 cm2盖玻片上，细胞按分组继续培养后，以多聚甲醛(4 %)固定0.5 h，而后H2O2(3%)去离子水孵育5 min；山羊血清(10 %)封闭孵育10 min；加入AKAP150兔抗鼠和PKC鼠抗鼠(1∶200)抗体，4 ℃过夜，室温下孵育2 h，复温后，加入FITC标记的山羊抗小鼠(绿色)和罗丹明(红色)标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；DAPI作用5 min，甘油密封；激光扫描共聚焦显微镜荧光激发，观察细胞内的荧光分子的表达和共定位。FITC及罗丹明标记荧光强度升高提示PKC与AKAP150结合。

2 结果

观察组、对照组细胞PKC活性分别为0.231±0.037、0.143±0.047，二者比较，P<0.05；观察组、对照组细胞AKAP150蛋白相对表达量分别为0.527±0.080、0.124±0.038,二者比较，P<0.05。两组细胞AKAP150蛋白电泳图见图1。

图1 两组细胞AKAP150蛋白电泳图

对照组PKC与AKAP150结合较少，而观察组FITC及罗丹明标记荧光强度升高，提示与对照组比较，观察组细胞PKC与AKAP150结合明显增多。

3 讨论

DM是以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病，因多种病因导致人体胰岛素分泌相对或绝对不足，或者组织对胰岛素敏感性下降。DM不仅仅是血糖升高，同时可导致脂类、蛋白质等多种物质代谢、转化紊乱。长期、慢性的高血糖环境可以引起多种器官及系统并发症，使DM并发症发生率、致残率、病死率明显升高。近些年DM患者的发病率迅速上升，DM并发症危害日趋严峻，以心血管并发症尤为突出，约70%的DM患者最终死于心血管疾病[2]。DM的慢性高血糖环境导致心肌微血管损伤是DM心血管并发症的重要原因之一，其机制包括心肌微血管内皮细胞连接不完整、屏障功能降低、心肌微血管密度降低、微血管数/心肌纤维数比率降低等，这些变化导致了心肌微循环障碍，造成心肌局部或整体氧供与血流量失衡，加重心肌缺氧易损性[7]。

近年PKC在心肌细胞及微血管内皮细胞中的作用受到关注[8]。PKC是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，根据蛋白结构、分布和底物结合上的差异，分为经典型PKC(cPKC)、非典型PKC(aPKC)和新型PKC (nPKC)[9]。PKC在全身组织细胞中均表达，作为细胞内重要信号传递分子，起到胞内信号传递的功能。普通情况下，PKC未被激活，定位在于胞质内，处于无活性状态。如果接收上游分子信号后，PKC向细胞膜转位，并被相关膜蛋白磷酸化后被激活。PKC的磷酸化状态反映PKC激活水平。而PKC参与了DM心血管并发症过程，在慢性高血糖状态下，异常激活PKC在RAAS系统激活、心肌细胞氧化应激、钙超载等损伤机制中起重要作用。相关报道[10]显示，DM大鼠心肌组织中，均观察到PKC在细胞膜、细胞核、细胞骨架和胞浆表达升高，且心肌细胞中总PKC活性增加。而在高糖预处理下，在新生乳鼠心肌细胞中观察到PKCα表达增多且活性增加，通过激活下游通路NF-κB而致心肌细胞损伤。同时，在DM大鼠模型的心肌细胞中，PKC总活性增加，与大鼠心功能的下降相关[5]。而在DM猪模型中，心肌组织 PKC的转录水平明显升高，并参与DM心血管损伤的过程[11]。我们观察了DM条件下心肌微血管内皮细胞中PKC的活性状态。结果显示，与正常对照组相比，观察组心肌微血管内皮细胞PKC活性明显升高，这与上述研究中发现高糖预处理心肌细胞PKC活性升高一致。

AKAPs是激酶锚定蛋白家族成员之一，作为胞内锚定蛋白，介导了细胞外的信号向细胞内传导，目前其生理功能及在多种疾病中的作用越来越受到关注。其具体作用是AKAPs锚定相关激酶结合后，将激酶转移至在胞内合适部位被激活，并暴露激酶的活化位点，加快激酶对作用底物的快速反应，从而使底物更快、更容易被激酶活化而激活底物[12]。最初的研究发现AKAPs通过与PKA RⅡ亚基结合调节PKA的激活，加快信号的传递，且具有靶向特异性的特点。更进一步的研究发现生理状态AKAPs在维持细胞生长、增殖，代谢，递质传递等起到主要的作用，其定位于细胞膜、核膜、高尔基体、骨架复合体等，与多种激酶结合后，调节多种激酶的活性，从而调控信号通路的传导。在心脏中，生理状态下的AKAPs主要作用于心肌细胞的变时性、变力性及自律性等方面，而在病理状态下，AKAPs在心力衰竭、心律失常、心肌重构、甚至心脏肿瘤等疾病中都起到相应作用[13]。

AKAP150是AKAPs家族主要成员，研究[14]发现激酶中有PKA、PKC、钙调磷酸酶等能够受AKAP150的调节，并通过调控激酶的活性作用于磷脂酶，环磷酸腺苷，钙离子等信号通路的传递。我们前期研究发现，在心肌细胞中，AKAP150能够与PKC锚定，加快PKC向细胞膜转位及磷酸化水平，并加快PKC对下游信号分子的激活[6]。还有研究[15]报道AKAP150作用下PKC加快激活膜上离子通道，如L型钙离子通道，钾离子通道等。Navedo 等[16]敲除动脉血管平滑肌细胞的AKAP150分子，使用血管紧张素预处理后，观察PKC转位及激活基本消失，且未检出钙火花的发生，并提示PKC激活必要依靠AKAP150。而DM状态下心肌微血管内皮细胞PKC的异常激活机制仍不明确。本研究结果显示，与正常对照组比较，观察组心肌微血管内皮细胞AKAP150蛋白相对表达量明显升高，且与PKC活性增加相一致，免疫荧光共定位显示高糖预处理小鼠心肌微血管内皮细胞AKAP150与PKC结合明显增多，提示AKAP150可能在DM心肌微血管内皮细胞损伤中扮演重要角色，很有可能是通过调节PKC的活性而发挥作用的。我们下步工作是研究AKAP150在DM心肌微血管内皮细胞的具体损伤作用。但目前高血糖调节心肌微血管内皮细胞AKAP150表达水平的机制不明，本研究推测可能是高糖可作用AKAP150启动子，从而增加AKAP150基因的转录，但需要进一步研究证实。

综上所述，高糖预处理的小鼠心肌微血管内皮细胞PKC活性升高、AKAP150表达升高。PKC活性水平及AKAP150表达升高可能在高糖导致的小鼠心肌微血管内皮细胞损伤中起重要作用。