补骨脂对维甲酸诱导的大鼠骨质疏松的治疗

刘 颖 袁晓美 毕亚男 高玉娜 周 昆 李云章

(1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018)(2. 天津中医药大学中医药研究院，天津市中药药理重点实验室，天津 300100)

中药补骨脂为豆科植物补骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果实，始载于《开宝本草》，又名破故纸。性温，味辛、苦。中医常用于治疗肾阳不足，阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝冷痛，肾虚作喘，五更泄泻；外用治白癜风，斑秃。现代研究表明补骨脂有扩张冠脉、增加冠脉血流量、抗肿瘤、保肝、抗早孕、雌激素样、抗骨质疏松、抗前列腺增生、平喘、提高免疫力等作用[1]。补骨脂主要含香豆素类(主要为呋喃香豆素类，如补骨脂素psoralen和异补骨脂素isopsoralen等)；拟雌内酯类(如补骨脂定psoralidin等)；黄酮类(主要有补骨脂甲素corylifolin、补骨脂乙素corylifolinin、补骨脂异黄酮corylin、补骨脂查耳酮bavachalcone等)；酚萜类(如补骨脂酚bakuchiol)化合物等，其中多个成分具有雌激素样作用[2]。研究表明植物雌激素有着和天然雌激素相似的抗骨质疏松症作用，且少有雌激素样副作用的发生。体外研究提示补骨脂中多个成分可能有抗骨质疏松作用[3]，且体内研究已经证实作为补骨脂重要成分的补骨脂素和异补骨脂素对小鼠骨质疏松有较好的治疗作用[4]。

补骨脂常用方式为水煎，脂溶性的补骨脂酚等成分水煎基本不能提取出来，而水煎后剩余部分是否同样具有抗骨质疏松作用尚未有研究证实。为此，本实验采用维甲酸致骨质疏松模型，观察补骨脂生药、水提物及药渣对维甲酸致骨质疏松大鼠的影响，探讨药渣对大鼠骨质疏松的疗效，为补骨脂的合理应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，60只，雌雄各半，体质量190～210 g，SPF级，购自北京华阜康生物科技有限公司，合格证号：SCXK(京)2009-0004。动物饲养于天津中医药大学实验动物中心，饲养温度20～25 ℃，湿度40%～60%，自然光照。所用饲料为天津市华荣实验动物科技有限公司生产全价颗粒饲料,许可证号：SCXK(津)2012-0001，饮用净化自来水。

1.2 受试药物

补骨脂生药，由深圳华润三九医药股份有限公司提供。补骨脂水提物，批号20120920，4.78 g生药/g粉；补骨脂药渣，批号20120920，1.33 g生药/g粉；均为天津中医药大学中医药研究院王跃飞副研究员团队制备提供。

1.3 试剂

维甲酸，戊巴比妥钠(北京索莱宝科技有限公司)；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(北京中生北控)；酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；乙醇，甲醛(天津市康科德科技有限公司)。

1.4 仪器

VivaCT40骨密度仪(瑞士，SCANCO Medical AG)；7020全自动生化仪(日本，Hitachi)；InfiniteM200多功能读板仪(瑞士，TECAN)；AE200S电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；JJ2000精密电子天平(常熟双杰测试仪器厂)；Micro 17 R高速离心机(美国，Thermo)；LDZ5-2型离心机(北京医用离心机厂)。

1.5 方法

1.5.1分组及给药：60只Wistar大鼠适应性饲养7 d，随机分为对照组、模型组、补骨脂生药组(0.9 g生药/kg)、补骨脂水提物组(0.9 g生药/kg)、补骨脂药渣组(0.9 g生药/kg)5个组，每组12只。除对照组外，其余各组灌胃给予维甲酸70 mg/kg，连续14 d。造模后，大鼠依各组别剂量，按1 mL/100 g体质量灌胃给药，连续给药8周，对照组及模型组给予相应体积的饮用水。

1.5.2实验数据采集：动物用戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血并离心得血清，用全自动生化仪检测碱性磷酸酶(ALP)，酸性磷酸酶(ACP)按试剂盒说明书进行检测。取大鼠胫骨，用75%乙醇浸泡，每天换液，连续3 d，随后置无水乙醇中长期保存。使用VivaCT 40骨密度仪进行胫骨CT扫描，进行骨密度分析。主要检测指标为骨密度(of BV)、骨连接度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.6 统计方法

2 结果

给药8周后，补骨脂生药组，水提组，药渣组的ACP与模型组相比均有明显下降，有统计学意义。其中补骨脂药渣组下降程度>生药组>水提物组；比较ALP/ACP值，药渣组>生药组>水提物组>模型/对照组(见表1)。

表1 补骨脂给药8周各组血清中ACP和ALP含量Table 1 Serumindexes of rats of each groupafter8 weeks’ administration

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

用VivaCT 40骨密度仪对大鼠胫骨进行骨CT扫描，各给药组与模型组相比，生药组、水提物组和药渣组的骨密度要高于模型组，其中药渣组具有显著性；各给药组的骨连接度和骨小梁数均显著高于模型组，而骨分离度均显著低于模型组，有统计学意义(见表2,图1)。给药后各组指标与对照组均无统计学差异。

表2 补骨脂给药8周各组大鼠胫骨CT指标Table 2 CT indexes of rat tibia after 8weeks’ administration

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01

表2 (续)补骨脂给药8周各组大鼠胫骨CT指标Table 2 (Continued) CT indexes of rat tibia after 8weeks’administration

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01

图1 各组大鼠胫骨CT图像Fig.1 3D spiral CT images of rat tibia

3 讨论

骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加以致易于发生骨折的一种全身性的骨骼疾病[4]。维甲酸是维生素A的衍生物，可影响骨的生长、发育和代谢。维甲酸在用于肿瘤或银屑病等治疗当中，常引发骨痛、骨质疏松等不良反应。有文献报道，维甲酸可促进成骨细胞的增值和分化，又可增加破骨细胞的骨吸收，造成高转化型的骨质疏松，但总趋势是骨吸收大于骨形成[5]。且大鼠灌胃给予维甲酸来引导建立模型，与去卵巢法相比，操作简单，成模时间短，因此被许多研究者采用。本实验中选用成年大鼠，灌胃给予维甲酸70 mg/kg，连续14 d建立骨质疏松模型，且未出现其他文献提到的高死亡率现象[6]。从胫骨CT重建图像上看，维甲酸诱导的病变并不是典型的骨质疏松状态，其对软骨组织的破坏更加明显，与刘和娣等[7]研究结果相符。

预实验中我们用活体进行扫描，希望在实验过程中根据扫描结果决定是否继续给药，节约动物资源的同时还可以减少实验中的误差，保证同批大鼠实验的准确性。但活体扫描后大鼠死亡率达到3/4以上，解剖可见明显的脏器损坏，可能与射线下暴露时间过长(扫描时间30 min)有关，故本实验中采用离体CT扫描方法。

补骨脂不同工艺给药治疗，主要关注补骨脂药渣对维甲酸骨质疏松模型的治疗作用，根据大鼠血清生化指标及胫骨骨CT扫描结果，补骨脂药渣组的骨密度、骨小梁数和骨连接度均明显高于模型组，骨分离度明显低于模型组，血清酸性磷酸酶比模型组显著降低，且具有统计学意义。显示补骨脂药渣对维甲酸诱导的骨质疏松模型的大鼠有治疗作用，且治疗效果显著。中药绝大多数来源于植物，其药渣中含有粗纤维、粗蛋白、粗脂肪以及多种微量元素等。近年来，中药药渣主要从以下几个方面进行再利用：再提取其他有效成分、用于栽培食用菌、用作饲料或饲料添加剂、制成有机肥料、处理废水、用作生物质能源、用作造纸原料、用于发酵生产等[8]。本研究证明了补骨脂药渣对维甲酸造成的大鼠骨质疏松有一定疗效，为药材的充分利用及开发制药新工艺提供了理论依据。

自2005年韩国报道44岁妇女因以补骨脂泡茶饮用而导致急性胆汁淤积性肝损害[9]，近年来补骨脂的肝毒性成为研究热点。前期研究发现，补骨脂水提物及其主要成分补骨脂素和异补骨脂素有肝毒性[10-11]，而本研究提示补骨脂药渣同样有良好药效，如果其肝毒性较低，那么补骨脂水提取后的药渣将成为一个新的可用部分。因此，补骨脂水提取后的药渣的安全性考察将成为进一步研究的方向。