2017年北京地区啮齿类实验动物健康状况的病理学调查和分析*

2018-08-20 09:48:34宋银娟张茜茜陈合花段玉涵徐宏伟董浩迪杨利峰赵德明周向梅
实验动物科学 2018年1期
关键词:豚鼠肺脏病理学

宋银娟 张茜茜 陈合花 廖 轶 段玉涵 吴 伟 孙 欣 王 璐 徐宏伟 姚 娇 董浩迪 杨利峰 赵德明 周向梅

(中国农业大学动物医学院,国家动物海绵状脑病实验室,北京 100193)

实验动物是指在一定条件下人工饲养繁殖,具有特定的生物学特性,用于科学研究的动物。实验动物在生命科学研究中起着不可替代的作用,实验动物的健康状况直接关系到实验结果的可靠性和准确性[1]。因而,实验动物的健康状况在生命科学研究中至关重要。

本实验室自2009年以来每年都对北京地区啮齿类实验动物质量进行病理学调查和分析。2017年5月对北京市16 家实验动物单位的共330只啮齿类实验动物主要器官、组织进行样品采集,组织切片制作,HE染色,部分组织进行了油红O和PAS染色,然后进行病理学观察和统计分析。调查结果显示所抽检的330例啮齿类实验动物总体处于健康状态,但也有个别动物出现肝脏脂肪变性、肝脏局灶性坏死、肺萎陷、 小肠嗜酸性粒细胞增多及脾脏陈旧性出血等病变。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2017年5月,由中国食品药品检定研究院从北京市16家实验动物单位分别抽取一定数量的SPF级、清洁级的小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和普通级豚鼠四种实验用鼠进行调查和分析,具体情况见表1。

表1 2017年5月啮齿类实验动物采样情况Table 1 Classification of samples of laboratoryrodents in May 2017 只

1.2 实验方法

1.2.1组织切片的制备和观察: CO2窒息处死动物,采集动物的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠和大肠。经甲醛钙液(10%甲醛+1%氯化钙)固定后按常规方法制作石蜡切片,HE染色,OLYMPUS U-SRG数码显微镜观察并采图。

1.2.2肝脏油红O染色:对HE染色观察中有中度及以上细胞肿胀的肝脏样品, 抽取部分样品进行油红 O 染色。主要步骤为: 组织块用甲醛钙液(10%甲醛 + 1% 氯化钙)固定一周, 肝脏组织制作冰冻切片,油红 O 染色,50%乙醇脱色,苏木素复染核,甘油明胶封片后显微镜下观察并采图。

1.2.3肝脏PAS 染色:同时对HE染色观察出现中度及以上细胞肿胀的肝脏样品进行PAS 染色。主要步骤为:甲醛钙液固定,制作肝组织石蜡切片,高碘酸氧化,Schiff 氏试剂染色,苏木素复染细胞核,甘油明胶封片后显微镜下观察并采图。

2 结果

2.1 实验鼠肝脏病理学变化及统计

2.1.1镜下变化:显微镜观察结果显示,实验鼠肝脏以细胞出现不同程度的肿胀变性为主,另有一例小鼠出现肝脏局灶性坏死。与正常肝脏(图1 A)相比,肝细胞肿胀样本镜下可见肝细胞体积变大,胞浆内有大小不等、呈圆形或椭圆形的空泡,有的空泡融合在一起,胞核被挤向一侧;也可见部分肿胀的肝细胞胞浆内呈颗粒状,中央静脉和肝血窦可见红细胞(图1B、C)。肝脏坏死样本镜下可见坏死区域肝细胞索结构消失,肝细胞胞核固缩、溶解、消失,胞浆淡染;部分坏死区域出现大量红细胞。坏死区域周围有少量呈圆形、细胞核蓝染的淋巴细胞浸润(图1D)。

对肝细胞肿胀样本进行油红 O 染色,经显微镜观察油红 O 染色阳性的切片可见肝细胞轮廓和由苏木素蓝染的细胞核,胞浆内可见大量大小不一的圆形红色脂滴,有的围绕在细胞核周围,有的聚集呈大脂滴(图2A)。病变肝脏同时进行 PAS 染色,阳性样本可见肝细胞胞核周围有紫红色颗粒物质异常沉积,与未着色部分形成明显对比(图2B)。

2.1.2病变情况统计: 病理学观察结果显示在140例小鼠样本中,肝脏异常以细胞肿胀为主,经油红O染色检出脂肪变性2例,PAS染色确诊糖原沉积6例,另出现1例肝脏局灶性坏死。肝脏病变检出率6.4%。这可能与饲养环境和饲料不达标有关。大鼠肝细胞肿胀变性程度总体较严重,50例大鼠样本中,经油红O染色检出4例脂肪变性,病变率8%。120例豚鼠样本中,经油红染色确诊脂肪变性6例,PAS染色确诊糖原沉积5例;其中,有2例SPF级豚鼠肝脏既有脂肪变性又有糖原沉积,肝脏病变率7.5%。20例金黄地鼠样本肝脏均未见明显病变。

图1 肝脏HE染色(×40)注: A: 正常对照; B: 肝细胞肿胀; C: 肝脏空泡变性; D: 肝脏坏死灶Fig.1 Pathological changes of liver (HE ×40)Note: A: Normal liver; B: Hepatocellular swelling; C: Vacuolar degeneration; D: Focal necrosis

图2 肝脏变化情况注: A: 肝脏油红 O 染色阳性(×100); B: 肝脏 PAS 染色阳性(×40)Fig.2 Pathological changes of liverNote: A: Adipose degeneration (Oil Red-O staining, ×100); B: Glycogen deposition (PAS staining×40)

2.2 实验鼠其他器官的病理学变化及统计

2.2.1脾脏病变:小鼠发现2例脾脏含铁血黄素沉着(图3B),镜下可见淋巴细胞分化完好,未见明显异常,但局部区域可见大量吞噬了红细胞的巨噬细胞即棕褐色的含铁血黄素沉着。生理情况下在脾、肝、骨髓等组织内可形成少量的含铁血黄素,但当含铁血黄素局部沉积过多时,提示可能存在陈旧性出血。

图3 脾脏HE染色(×40)注: A: 正常对照; B:含铁血黄素沉着Fig.3 Pathological changes of spleen (HE×40)Note: A: Normal spleen; B: Hemosiderosis

2.2.2肺脏病变: 豚鼠肺脏检出2例肺淤血,1例肺萎陷,病变率2.5%。与正常肺脏(图4A)相比,肺淤血样本可见整个肺脏有大量红色物质淤积,肺泡结构不清,肺脏肺泡隔增宽;也可见细支气管和较大的血管内充满红细胞。部分区域可见少量粉染的蛋白样渗出物(图4B、C)。肺萎陷样本可见肺脏肺泡塌陷,肺泡隔显著增厚,肺间质和肺泡腔内有红细胞淤积(图4D)。小鼠、大鼠、地鼠肺脏均未见明显异常。肺脏出现淤血、萎陷和间隔增宽可能与饲养环境中的垫料、空气等因素及管理、处死方式有关。

图4 肺脏HE染色(×10)注: A: 正常对照; B、C: 肺脏淤血;D:肺萎陷Fig.4 Pathological changes of lung (HE×10)Note: A: Normal lung; B、C: Pulmonary congestion; D:Pulmonary collapse

2.2.3小肠病变: 清洁级大鼠检出1例小肠嗜酸性粒细胞增多。显微镜观察,低倍镜下可见小肠黏膜上皮有脱落,黏膜固有层有大量嗜酸性粒细胞呈弥漫性浸润(图5A)。高倍镜下可见嗜酸性粒细胞胞核呈分叶核、蓝染,胞浆红染(图5B)。生理情况下在肠道存在少量的嗜酸性粒细胞,但当其大量增多时提示肠道可能有炎症。

3 讨论

本次调查显示肝脏病变主要出现于小鼠、大鼠和豚鼠,金黄地鼠肝脏未见明显异常。小鼠肝细胞肿胀主要是由于糖原沉积造成,另有一例肝脏局灶性坏死;大鼠肝脏以脂肪变性为主,且均发生在清洁级大鼠;而豚鼠肝细胞脂肪变性和糖原沉积参半。肺脏病变主要发生于豚鼠,表现为肺脏淤血、渗出及肺萎陷。另有一例大鼠小肠嗜酸性粒细胞显著增多。两例小鼠脾脏含铁血黄素沉着。全部实验鼠的肾脏、大肠等脏器在镜下无明显病理变化。综上所述,绝大多数啮齿类实验动物为健康状态,个别动物出现病变可能与饲养环境、饲料和饮水质量以及采样运输的应激有关。

近七年来,本实验室共对3014例啮齿类实验动物的健康状况进行了病理学调查。其中包括不同数量不同级别的小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠。本次调查结果显示病变主要发生于肝脏和肺脏。HE染色显示肝脏总病变率为6.7%,油红O染色确诊肝脏脂肪变性率为3.6%,PAS染色确诊肝脏糖原沉积率为3.3%。肺脏病变主要发生于普通级的豚鼠中,总病变率为0.9%。另小肠和脾脏总病变率为0.3%和0.6%。

图6 2011年5月至 2017年5月北京市啮齿类实验动物病变检出率注:A:肝脏病变率;B:肺脏病变率Fig.6 The detection rate of rodent laboratory animal pathological lesions in Beijing from 2011 to 2017Note: A: Rate of liver lesions; B: Rate of lung lesions

从历年肝脏病变的统计分析来看(图6A),小鼠、大鼠和豚鼠的肝脏病变率均呈逐年下降的趋势,豚鼠仅在2016年5月检出肝脏病变,且病变率为5%。通常肝脏病变反映进食情况,而数据显示不论动物级别如何,肝脏均有一定程度病变,说明肝脏损伤可能与饲料有关,而各受检单位均使用目前市场上的成品饲料商品,可见其原料质量及配方有待规范。而饮水来源则根据级别要求使用自来水或高压灭菌自来水,故不排除自来水水质如微生物含量,重金属、消毒剂及农药残留和硬度等对实验动物健康的影响。秋冬季低温同样不容忽视,在低温环境下动物能量代谢加强, 需要通过增加采食量来维持热平衡, 如果饲料供应不足,同样会引起营养不良和抗病力下降,饲喂过度又易造成脂肪沉积,动物患肥胖病,故应规范饲喂量和饲喂次数[2-9]。

从历年肺脏病变的统计分析来看(图6B),小鼠、大鼠及豚鼠肺脏病变发生率均呈波动趋势,且每年秋季较为高发,2011年、2012年及2013年秋季肺脏病变检出率均达到高峰。2014年以来,肺脏病变率呈下降趋势。肺脏病变主要反映饲养环境空气情况,历年的调查结果显示,普通级的实验鼠肺脏病变检出率均较高。可见普通级动物的空气及垫料有待改善, 原因可能有垫料不合格及饲养密度过大等。劣质的垫料碎屑及尘埃较多,极易造成异物刺激引发动物肺部炎症;饲养密度过大、温湿度不适、通风不良和饲养员清理不及时,室内臭味和氨浓度升高容易诱发气管炎、肺炎等。因而,在实验动物的饲养过程中需要注意饲养环境的空气情况、饲养密度以及通风情况等,尽量减少室内垫料碎屑、臭味和氨味等对动物呼吸道的刺激[2-9]。

国际公认的动物福利标准是由世界动物卫生组织提出的动物应享受的五大自由:即享有不受饥渴的自由,享有生活舒适的自由,享有不受痛苦伤害和疾病威胁的自由,享有生活无恐惧和悲伤感的自由,享有表达天性的自由。实验动物福利要求在兼顾科学探索的基础上最大限度地满足实验动物的五大自由[10]。 本实验室连续七年的病理学调查都能观察到啮齿类实验动物的不同脏器出现不同程度的组织病理学损伤,主要有肝脏脂肪变性、肝脏局灶性坏死、间质性肺炎、脾炎、心肌出血、肾脏蛋白样渗出以及肠道寄生虫等[3],这些损伤证明实验动物单位的实验动物的饲养管理水平良莠不齐,个别没有达到实验动物的福利标准,部分实验动物处于亚健康状态。使用处于亚健康状态的实验动物对科学研究实验结果的可靠性和准确性会产生影响。虽然在每次实验动物的质量评价中,被检测动物的微生物学、寄生虫学和遗传学等指标都能达到或符合国家质量标准,但在病理学检测中都能观察到不同程度的组织病理学损伤。因而,通过病理学监测实验动物的健康状况对于更好地保障实验动物的福利和保证科学研究结果的可靠性和准确性都具有重要的意义。

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