LRIG1基因对胶质瘤SHG44的放疗增敏作用

方园 张仕涛 屈建强 张世荣 樊欣鑫 朱莽 罗强 王文涛

(1西安市第三医院神经外科，陕西 西安 710018; 2西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，陕西 西安 710003)

胶质瘤是起源于神经外胚层的中枢神经系统最常见恶性肿瘤，尽管采用手术、放疗、化疗等综合治疗手段，但患者预后均不乐观。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是表皮生长因子家族成员之一[1]，在包括脑星形细胞瘤在内的许多肿瘤组织中都呈现高表达，且和肿瘤分级密切相关，因此EGFR被作为许多肿瘤治疗的重要靶点。富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain proteins 1, LRIG1)[2]，在正常人体组织中均大量表达，但在多种肿瘤组织中表达低。近来研究发现[3]，LRIG1基因的表达与胶质瘤的病例分级及预后相关，并显示在胶质瘤细胞系中过表达LRIG1基因可显著抑制EGFR的表达。作为EGFR基因的抑制基因，LRIG1基因能否在胶质瘤细胞的放射治疗中起到增敏效应是我们最大关注点。为此我们用前期已成功构建重组质粒重组质粒pEGFP-C1-LRIG1，转染人脑胶质瘤细胞系44细胞(Suzhou human glioma Cells-44, SHG44)并稳定表达，后用6兆电子伏(6 mega-electron volts, 6MeV)直线加速器2 Gy剂量的射线照射，检测转染后SHG44细胞中LRIG1、EGFR基因的表达情况，并检测胶质瘤细胞的细胞活性、侵袭能力变化，探讨LRIG1基因对胶质瘤细胞SHG44的放射增敏效应及相应机制。

材料与方法

一、材料

人脑胶质细胞瘤SHG44细胞株(西安交通大学医学院实验室提供)；10%小牛血清(杭州四季青生物有限公司)；细胞培养基(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)、LRIG1一抗、EGFR一抗、辣根素羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)；真核表达载体pEGFP-C1(购自美国Clontech公司)，脂质体Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司)，质粒提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)，DNA 凝胶回收试剂盒(安徽优晶生物工程 有限公司)，G4l8、DMEM培养液(Gibco公司)，钴60治疗机(法国CGR公司，西安交大医学院实验室提供)。

二、方法

1.应用质粒转染技术将目的基因转入细胞：应用前期构建的重组质粒pEGFP-C1-LRIG1及空载质粒pEGFP-C1分别转染SHG44细胞，并筛选出稳定表达细胞株。按Invitrogen公司的Lipofectamine2000 Reagent说明书，重组质粒及空载质粒通过质粒转化、去内毒素质粒提取、细胞转染三步骤，完成SHG44细胞转染，后用G418(100 μg/μL)进行筛选。3 w后，挑选存活的细胞继续用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，在50 mL/L CO2中37 ℃培养。稳定表达后将胶质瘤细胞分三组：SHG44组、SHG44+pEGFP-C1组、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组。三组细胞分别接受来自6 MeV直线加速器2 Gy剂量的射线照射，检测各组间SHG44细胞对放射治疗的敏感性。

2.逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法及免疫组化实验：照射后应用RT-PCR法，检测SHG44组、SHG44+ pEGFP-C1组、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组三组中基因LRIG1和EGFR的表达情况，并比较其变化。PCR引物序列：LRIG1：forward：5'-CTACCGTGGTCACC CAGCCAGAAAG-3'，reverse：5'-CTACCGTGGTCC CATCCTT-3'，产物892 bp。EGFR：forward：5'-CACG CAGTTGGGGATTTTG-3'，reverse：5'-TTGGGACAGCTT GGATCAC-3'，产物474 bp。β-actin：forward：5'-AG CAGAGAATGGAAGTCAAA-3'，reverse：5'-ATGCTGCT TACATGTCTCGAT-3'，产物266 bp。并用免疫细胞法验证照射后三组细胞中LRIG1与EGFR基因蛋白表达情况。LRIG1 蛋白以细胞膜和/或细胞浆内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞，结果判定标准为：无染色细胞或阳性细胞数<10%为(-)，阳性细胞数为 10%～25%为(+)，阳性细胞数为 25%～50%为(++)，阳性细胞数为>50%为(+++)，以阳性细胞≥10%的病例视为阳性表达；EGFR蛋白以细胞膜和/或细胞质内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞，结果判定标准为：无染色细胞或阳性细胞数<10%为(-)，阳性细胞数为 10%～50%为(+)；阳性细胞数为51%～75%为(++)；阳性细胞数>75%为(+++)，以阳性细胞数≥10% 的病例视为阳性表达。

3.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法实验：SHG44组、 SHG44+pEGFP-C1组、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组三组细胞分别培养，制成细胞悬液，以每孔细胞悬液100 μL接种于96孔培养板，每96孔板上每组重复2孔，37 ℃、5% CO2孵育箱中培养，待24 h细胞贴壁，给予2 Gy照射；照射后24 h，加入配制好的MTT原液10 μL；继续培养4 h后终止培养，弃去上清液；每孔加150 μL二甲亚矾(dimethyl sulphoxide, DMSO)，振荡10 min，充分溶解结晶物；酶联免疫检测仪检测波长490 nm处的吸光度(optical density, OD)值；根据OD值计算各组中的存活率[细胞存活率(%)=细胞组OD平均值/对照组OD平均值×l00%]。

4.Transwell细胞侵袭实验(Transwell invasion)：在SHG44组、SHG44+pEGFP-C1组、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组三组细胞中，取对数生长期的细胞以2×104/孔加入底部铺有基底膜Matrige的Transwell小室，向下室加入含20%胎牛血清的DMEM培养基。接种后即给予2 Gy照射，继续24 h。将膜取出，用棉签擦除小室侧的细胞，下室面用苏木素染色，显微镜下计数穿过膜的细胞数。

三、统计学处理

结 果

一、重组质粒转染细胞并荧光显微镜下观察

重组质粒pEGFP-C1-LRIG1转染SHG44细胞，经培养稳定表达后用荧光显微镜观察目的基因LRIG1在SHG44细胞中的表达情况，见图1。

二、三组细胞中 LRIG1、EGFR mRNA的表达有明显差异

将目的基因扩增条带的灰度值与参照基因β-actin扩增条带灰度值的比值作为每个目的基因mRNA的半定量指标。结果显示SHG44、SHG44+pEGFP-C1组中LRIG1、EGFR基因未见明显差异(P>0.05)，SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组中LRIG1、EGFR基因较前两者有明显差异(P<0.01，表1)。

三、三组细胞中LRIG1、 EGFR蛋白的表达有明显差异

结果显示，将SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组结果作为对比组，与SHG44、SHG44+pEGFP-C1两组相比，基因LRIG1、EGFR的蛋白表达情况有明显差异(P<0.01)，而SHG44、SHG44+pEGFP-C1两组之间比较，基因LRIG1、EGFR的蛋白表达情况无差异(P>0.05，表2)。

四、重组质粒组肿瘤细胞的细胞活性明显下降

经2 Gy射线照射后，用MTT法比较SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+ pEGFP-C1-LRIG1三组细胞的细胞活性。结果显示SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组中胶质瘤细胞的细胞活性较其它两组有明显差异(P<0.01)，且显著减低；而SHG44、SHG44+pEGFP-C1两组中胶质瘤细胞的细胞活动无差异(P>0.05，图2)。

五、重组质粒组肿瘤细胞的侵袭能力明显下降

经2 Gy射线照射后，Transwell细胞侵袭实验比较SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三组细胞的侵袭能力。结果显示SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组中胶质瘤细胞的侵袭能力较其它两组有明显差异(P<0.01)，且显著减低；而SHG44、SHG44+pEGFP-C1两组中胶质瘤细胞的细胞活动无差异(P>0.05，图3)。

图1 重组质粒pEGFP-C1-LRIG1转染胶质瘤细胞SHG44后荧光显微镜与普通显微镜下观察对比(×200)

Fig 1 The expression of recombinant plasmid pEGFP-C1-LRIG1 transfecting glioma cells SHG44 by fluorescence microscope and general microscope (×200)

A: Fluorescence microscope; B: General microscope.

图2 SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三组细胞的细胞活性比较

Fig 2 The comparison of cell activity among SHG44, SHG44+pEGFP-C1, and SHG44+pEGFP-C1-LRIG1 groups

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

图3 SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三组细胞的细胞侵袭能力比较

Fig 3 The comparison of invasive ability of tumor cells among SHG44, SHG44+pEGFP-C1, and SHG44+pEGFP-C1-LRIG1 groups

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

GroupLRIG1EGFR SHG441.132±0.0812.820±0.343 SHG44+pEGFP-C11.202±0.0912.830±0.122 HG44+pEGFP-C1-LRIG12.351±0.157a0.706±0.124a

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

表2 LRIG1、EGFR在SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三组细胞中的蛋白表达情况 [n(%)]

Tab 2 The protein expression of LRIG1 and EGFR among SHG44, SHG44+pEGFP-C1, and SHG44+pEGFP-C1-LRIG1 groups [n(%)]

GroupLRIG1PositiveFeminineEGFRPositiveFeminine SHG4412(12)8881(81)19 SHG44+pEGFP-C120(20)8079(79)11 SHG44+pEGFP-C1-LRIG191(91)a912(12)a88

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

讨 论

胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤。据统计[4]，美国的颅内原发性肿瘤患者中，40%为胶质瘤；国内资料表明，胶质瘤约占颅内原发性肿瘤的35.26%～60.96%(平均44.69%)，其中绝大部分为恶性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。由于胶质瘤多呈浸润性生长，手术不可能全切，术后放疗是重要的辅助治疗手段。令人失望的是多种胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤对放疗并不敏感[5]。当前理论认为[6]，放疗增敏剂能够有效增加肿瘤的放疗敏感性。胶质瘤的放疗增敏剂主要是分子靶向放疗增敏剂。表皮生长因子受体(EGFR)被认为是最有希望的靶点之一。研究显示[7-8]在多种肿瘤细胞中，静止细胞中LRIG1的表达水平很低；但当细胞受到EGF刺激后，LRIG1的表达水平会明显增高，其胞外段的多亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样区可特异性的识别EGFR胞外段并与之结合，胞内段通过趋化作用吸引胞质内E3泛素激酶聚集于其附近(如c-cbl)，E3泛素化激酶通过结合EGFR并介导泛素化作用降解EGFR蛋白。可以看出，LRIG1蛋白是细胞受到EGF刺激后所产生的负反馈机制，LRIG1蛋白的缺失可使细胞中EGFR持续高表达。研究显示[9]，LRIG1的表达率与胶质瘤的恶性级别负相关(P<0.01)，并且LRIG1可以作为判定胶质瘤患者预后的独立预测指标。

本实验中SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三组细胞经同等条件照射后，检测LRIG1 与EGFR mRNA变化，并用免疫组化检测LRIG1与 EGFR 蛋白表达变化，结果显示SHG44、SHG44+pEGFP-C1组中，LRIG1 mRNA与EGFR mRNA的变化及表达后的蛋白情况均无明显差异(P>0.05)，而SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组细胞相对于前两组细胞，LRIG1与EGFR mRNA的变化及表达后的蛋白情况有明显差异(P<0.01)，再次验证了LRIG1与EGFR的负向调节关系。

LRIG1作为EGFR的负向调节剂，能否在胶质瘤放射治疗中起到增敏效果，是我们主要关注点。为此我们仍将SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三组细胞经同等条件照射后，用MTT发检测照射后细胞活性，用Transwell法检查照射后细胞的侵袭能力。结果显示照射后SHG44+pEGFP-C1-LRIG1组细胞，其细胞活性、侵袭能力均较前两者明显下降(P<0.01)，而SHG44、SHG44+pEGFP-C1两组细胞之间比较，其细胞活性、侵袭能力未见明显变化(P>0.05)。

综上所述，在胶质瘤细胞SHG44中过表达LRIG1基因可通过下调EGFR基因表达，抑制SHG44细胞的恶性生物学行为，增加放射治疗的敏感性。