舱室内爆震伤后HIF-1α、NF-κB在犬脑和肺组织的表达及其相关性

毛汉丁 程岗 刘帅 李彦腾 刘邦鑫 张剑宁*

(1解放军医学院, 北京 100853; 2海军总医院神经外科，北京 100048)

本实验在模拟海军舰船多舱室场景下实施爆炸，造成颅脑爆震伤(blast-induced traumatic brain injury, bTBI)合并肺损伤模型，并对实验犬的受损器官组织进行病理形态学观察以及缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)，核转录因子κB(nuclear factor-κ B, NF-κB)等相关因子的免疫组化检测，分析这些因子在脑、肺组织中的表达及其相关性，了解舱室内爆炸后继发性脑、肺损伤特点，以期为今后此类伤情的早期诊治和继发性损伤的预防提供一定的理论及实验依据。

材料与方法

一、实验动物分组与致伤方法

健康、成年比格犬24只，体重9～11 kg，月龄约10～12个月。选择0.65 kg三硝基甲苯(2, 4, 6-Trinitrotoluene, TNT)裸药作为实验爆源，放置于模拟舰船舱室当舱，相邻舱室为邻舱。实验犬随机分为两组，每组12只，分别放置于当舱和邻舱中并固定，距离爆源水平距离2 m、等高度，麻醉后接受爆炸试验。另设置2只犬麻醉后直接处死，作为正常对照。其他模型设置细节详见参考文献[1]。

二、伤情观察与病理学检查

观察不同舱室犬爆炸后的伤亡情况，以及冲击波对颅脑、胸壁、肺脏等部位的损伤情况。即刻解剖死亡致伤犬和正常对照犬，取犬脑海马组织及受伤肺组织, 常规切片后HE染色观察光镜下损伤改变。免疫组化采用PV法，检测犬海马、肺组织中HIF-1α，NF-κB p65的表达。在未知标本一般资料的情况下采用双盲法进行计数，以胞核或胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。致伤犬每个海马及肺组织观察3张切片，每张切片上随机选择3个视野，取平均值；由于正常对照犬数量有限，每只犬同时取左、右侧海马和肺(n=4)，各观察3张切片，每张切片上随机选择3个视野，取平均值。表达结果以免疫组化评分(immunohistochemical scores, IHS)进行判定，IHS评分取细胞阳性百分率及细胞染色强度之和，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中等阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统。

三、统计学处理

根据数据类型分别使用独立样本的秩和检验(Mann-Whitney Test)，等级相关检验(Spearman相关分析)等检验方法，检验水准(α)取0.05。采用SPSS Statistics Data Editor V17.0软件进行统计学分析。

结 果

一、致伤后动物伤亡情况

接受爆炸实验的24只比格犬中，共死亡11只，爆炸后30 min内死亡6只，认定为现场即刻死亡，2 h内死亡(不包括即刻死亡)3只，超过2 h后死亡2只；即刻死亡犬5只来自于当舱，1只来自于邻舱；非即刻死亡犬3只来自于当舱，2只来自于邻舱。当舱犬死亡8只，总死亡率为(66.7%，n=12)，高于邻舱犬总死亡率(25.0%，n=12)；其中，当舱犬即刻死亡率为41.7%(5/12)，非即刻死亡犬伤死率为42.9%(3/7)，均高于邻舱犬(即刻死亡率8.3%，1/12；伤死率18.2%，2/11)。

二、形态学变化

1.大体标本观察：死亡犬均存在明显头部外伤，包括颅骨骨折，硬膜外出血及血肿，硬膜破损，脑组织挫伤等(图1A)。现场即刻死亡的6只犬均合并明显胸肺部损伤(54.5%，n=11)。具体包括：肋骨多根多处骨折(9.1%，n=11)，肺组织碎裂、出血(18.2%，n=11)，肺淤血、水肿(54.5%，n=11)等(图1B)。

2.显微病理学观察：光镜下可见海马组织形态结构异常，主要表现为脑血管扩张充血，神经细胞弥漫性肿胀，胞浆和胞核染色变淡，并可见毛细血管破裂出血。伤后存活超过2 h犬，脑水肿的程度明显较重，范围明显增大，出现神经元数目减少，核溶解或核仁消失，细胞界限模糊，可见到炎细胞浸润(图1C)。损伤肺组织周边见不同程度的出血、坏死及大量炎细胞浸润，支气管粘膜上皮脱落；肺泡腔及间质内可见大量红细胞及水肿液填充，部分肺泡腔萎陷；肺间质水肿明显，肺泡间隔不同程度增厚，小血管扩张充血，血管腔内可见炎细胞附壁聚集排列(图1D)。

3.免疫组化结果：正常对照犬脑、肺组织中，HIF-1与NF-κB的表达主要为弱阳性表达，未见中等阳性及强阳性表达；而致伤犬脑及犬肺组织中，HIF-1α、NF-κB的表达主要为中等阳性或强阳性表达。相较正常犬，致伤后犬脑及犬肺组织HIF-1α、NF-κB的表达上调(见表1、图2)。

分别将犬脑海马组织及肺组织的HIF-1α、NF-κB表达情况进行汇总，分析HIF-1α在脑、肺组织中表达的相关性，经Spearman相关分析检验，无统计学意义(相关系数r=0.239，P=0.479，n=11)；同法分析NF-κB在脑、肺组织中表达的相关性，无统计学意义(相关系数r=0.216，P=0.524，n=11)。进一步按存活时间分组，即分为现场即刻死亡组(n=6)、非即刻死亡组(n=5)。经Spearman相关分析检验，现场即刻死亡组中，HIF-1α在脑、肺组织中的表达无显著相关性(相关系数r=-0.233，P=0.656，n=6)，NF-κB在脑、肺组织中的表达同样无显著相关性(相关系数r=-0.556，P=0.242，n=6)；而非即刻死亡组中，NF-κB在脑、肺组织中表达的呈显著正相关(相关系数r=0.968，P=0.007，n=5，见表3)，而HIF-1α在脑、肺组织中表达呈正相关趋势(相关系数r=0.825，P=0.086，n=5，见表2)，统计学差异虽不显著，但考虑样本量较小，仍提示有较大正相关趋势。

进一步考察HIF-1α与NF-κB的表达是否具有相关性。经Spearman相关分析检验，相关系数r脑=0.731，P脑=0.011(n=11)，相关系数r肺=0.683，P肺=0.021(n=11)，可认为无论脑组织或肺组织，二者在伤后的表达呈正相关性，且具有统计学意义。

图1 爆震伤脑、肺组织病理形态学变化

Fig 1 Pathomorphorlogical changes in brain and lung tissues after blast injury

A: Ruptured and swelling brain tissues; B: Severe bilateral pulmonary congestion edema; C: Diffuse swelling of nerve cells and cavitation of cytoplasm (HE, ×400); D: Desquamation of bronchial cells, interstitial edema, alveolar septum broadening, infiltration of inflammatory cells (HE, ×400).

图2 爆震伤后HIF-1α、NF-κB在脑、肺组织的表达

Fig 2 Expression of HIF-1α and NF-κB p65 in hippocampi and lung tissues after blast injury

A, B, E, F: immunohistochemical staining in hippocampi (×400); C, D, G, H: immunohistochemical staining in lung tissues (×400).

表1 HIF-1α及NF-κB的表达情况 [n1=11,n2=4,n(%)]

Tab 1 Expressions of HIF-1α and NF-κB [n1=11,n2=4,n(%)]

IHS*HIF-1αBrain tissuesLung tissuesNF-κBBrain tissuesLung tissues InjuredControlInjuredControl InjuredControlInjuredControl -0 (0)0 (0)0 (0)0 (0) 0 (0)0 (0)0 (0)0 (0) +2 (18.2)4 (100)2 (18.2)4 (100) 3 (27.3)4 (100)2 (18.2)4 (100) ++4 (36.4)0 (0)3 (27.3)0 (0) 0 (0)0 (0)4 (36.4)0 (0) +++5(45.4)0 (0)6 (54.5)0 (0) 8 (72.7)0 (0)5 (45.4)0 (0) Total11 (100)a4 (100)11 (100)a4 (100) 11 (100)a4 (100)11 (100)a4 (100)

*IHS: immunohistochemical scores; Using Mann-Whitney U-test,aP<0.05,vsControl.

表2 非即刻死亡犬HIF-1α在脑、肺组织的表达 [n=5,n(%)]

Tab 2 Expression of HIF-1α in brain and lung tissues of died-over-time dogs [n=5,n(%)]

HIF-1α in lungHIF-1α in brain++++++Total +1 (20.0)0 (0)0 (0)1 (20.0) ++0 (0)1 (20.0)0 (0)1 (20.0) +++0 (0)1 (20.0)2 (40.0)3 (60.0) Total1 (20.0)2 (40.0)2 (40.0)5 (100)b

bUsing Spearman's rank correlation test,r=0.825,P>0.05.

表3 非即刻死亡犬NF-κB在脑、肺组织的表达 [n=5,n(%)]

Tab 3 Expression of NF-κB in brain and lung tissues of died-over-time dogs [n=5,n(%)]

NF-κB in lungNF-κB in brain++++++Total +1 (20.0)0 (0)0 (0)1 (20.0) ++1 (20.0)0 (0)0 (0)1 (20.0) +++0 (0)0 (0)3 (60.0)3 (60.0) Total2 (40.0)0 (0)3 (60.0)5 (100)c

cUsing Spearman's rank correlation test,r=0.968,P<0.05.

讨 论

一、HIF-1在爆震伤后的表达

HIF-1是缺氧条件下诱导转录的异质二聚体，由持续表达的β亚基和受细胞内氧浓度调节的α亚基组成[2]。缺氧条件下，α亚基趋于稳定并向细胞核移位，结合β亚基后形成活性HIF-1，通过与特定靶基因结合而调控多种反应蛋白。

在脑卒中的研究模型中，HIF-1α被认为可在缺氧性损伤中保护神经元；反之，使用HIF-1α特异性抑制剂会加重神经损伤[3]。HIF-1α在TBI后同样增强表达，但研究者对TBI中HIF-1α的作用尚有争议。Umschweif研究后认为HIF-1在脑缺血和TBI后的细胞反应中起“双重作用”：HIF-1在TBI后早期可能会破坏血脑屏障，加重脑水肿和细胞凋亡；但是，在TBI中后期，HIF-1调控的分子信号会促进血管再生，调节糖酵解和EPO生成，提高细胞生存能力，在神经保护中起到至关重要的作用[4]。关于外伤性胸肺损伤后肺HIF表达情况的研究尚不多见，尚无HIF-1在不同组织中表达相关性的研究。

实验中，我们发现HIF-1α在即刻死亡比格犬的脑、肺组织中的表达无明显相关性，而在非即刻死亡的比格犬脑、肺组织中的表达具有较大相关性趋势(r=0.825，P=0.086，见表2)，而且随着存活时间的延长，其相关系数增加(未详列数据)。该结果提示，爆炸30 min内，组织中的HIF-1α的表达可能主要与原发性致伤因素相关，而随着时间延长，HIF-1α的表达主要与脑、肺间的共同继发性损伤因素相关。相似的结果同样出现在NF-κB的表达分析中(r=0.968，P=0.007，见表3)。

二、NF-κB的表达及其与HIF-1的相关性

虽然HIF被认为是细胞缺氧反应中最重要的信号分子之一，但NF-κB同样在细胞缺氧反应中被激活，这在各种类型细胞实验中被证明[5]。NF-κB是一个转录因子蛋白家族，在体内主要起调节炎症和抗凋亡的作用，其在缺氧反应中的表达机制及作用机制尚在研究中，但NF-κB被认为是联系炎症反应与缺氧反应的重要纽带，该因子与HIF-1α有着广泛的交联，包括接受共同的刺激，相同的调节子和作用靶点等[6]。这些研究将对颅脑爆震伤合并肺损伤后的损伤作用提供一个新的治疗靶点。

本实验中，脑、肺组织中均可见NF-κB的明显阳性表达，且无论伤后存活时间长短，伤后不同组织中HIF-1α与NF-κB的表达均呈正相关(r脑=0.731，P脑=0.011；r肺=0.683，P肺=0.021)，证明了两者在伤后的炎症和缺氧反应中具有一定的关联。

三、舱室内爆炸后不同舱室的致伤特点

海战时致伤因素较陆战环境更为复杂[7]，而且在舰船的不同舱室，人员受到爆炸带来的冲击程度有明显差别。实验中我们发现，爆炸带来的初级(原发性)损伤[8]，是动物现场即刻死亡的主要因素。尤其是当舱中实验犬，41.7%(5/12)于现场即刻死亡，均合并脑、肺组织的冲击波多发伤，且无论爆炸后即刻死亡率或是伤后死亡率，当舱犬均远大于邻舱犬，提示爆炸当舱中动物受损伤程度更重。结合上述免疫组化结果的分析，随着时间延长，脑、肺组织中的HIF-1α、NF-κB的表达主要与脑、肺间的共同继发性损伤因素相关。邻舱犬虽受到爆炸带来的直接性损伤作用相对较轻，但也会在冲击波作用下合并脑、肺组织多发伤，且损伤更加隐匿，如果不能阻断其继发性致伤因素，仍将造成致命性后果。值得警惕的是，邻舱犬的伤死率(18.2%)明显高于即刻死亡率(8.3%)。因此，在舰船上发生爆炸后的早期战场救治及后续治疗中，除对原发性损伤的常规救治，对缺氧反应和炎症反应等继发性损伤因素的控制也尤为重要。

本实验主要通过对实验犬海马、肺组织进行病理形态学观察，以及相关因子的免疫组化检测，分析HIF-1α、NF-κB在各组织中的表达特点及其相关性。实验发现，随着爆炸致伤后存活时间的延长，HIF-1α、NF-κB在脑组织中的表达与在肺组织中的表达具有相关性，提示二者的表达可能与脑、肺间的共同继发性损伤因素(缺氧、炎症等)相关；而且HIF-1α与NF-κB之间的正相关性，表明二者在颅脑爆震伤合并肺损伤后的损伤机制中存在某种联系，而这种联系很可能是伤后缺氧反应与炎症反应的串联机制。另外，我们的实验还发现无论爆炸后即刻死亡率或是伤后死亡率，当舱犬均要远大于邻舱，提示战时发生爆炸后当舱中人员受损伤程度更重，但救治邻舱中的伤员时应积极预防继发性损伤带来的不利影响。