三叉神经痛模型大鼠三叉神经节中P2Y1受体的时序表达分析

刘悦雁，李 峰，吴剑峰，余 宏，解 敏

(1.皖西卫生职业学院 生理学教研室，安徽 六安 237005；2.安徽医科大学 生理学教研室，安徽 合肥 230032)

神经性疼痛是指各种原因引起的以神经病理性改变为基础的顽固性疼痛，通常以痛觉过敏、痛觉超敏和(或)异常疼痛为主要临床特征。三叉神经痛(trigeminal neuralgia，TN)以面部三叉神经分布区呈现突发的阵发性、周期性刺痛为主要临床特征，病因仍不明确。三叉神经根的脱髓鞘改变可能是TN的病理基础[1]。

神经损伤后释放三磷酸腺苷(ATP)[2]，并与腺苷受体结合。腺苷受体P2Ys为G蛋白耦联受体[3]。研究表明，P2X2、3、4、7等受体参与神经性疼痛[4-5]。本课题组也发现，P2X2、3在眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)中参与了急性痛及疼痛维持[6]。P2Y2[7]、P2Y12、13、14[8-9]等则参与了神经性疼痛的维持。P2Y1受体表达于大脑皮层、海马、背根神经节、三叉神经节等中枢和外周神经系统[10]，但其在TN过程中的变化规律尚不清楚。

为了探讨TG的神经元中P2Y1受体在CCI-ION所致的TN过程中的变化规律，本实验拟观察CCI-ION模型大鼠的行为学改变和三叉神经节(TG)的神经元中P2Y1受体表达的动态改变，为TN的临床治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级雄性SD大鼠68只(80～120 g)，来自安徽医科大学实验动物中心(合格证号：皖医实动准字第01号)。随机分为3组，正常对照组(4只)、假手术组(32只)和手术组(32只)，假手术组和手术组在术后每周各取4只作相应的手术处理。

1.2 主要试剂 P2Y1兔抗鼠多克隆抗体及HRP标记的鼠抗兔二抗购自Abcam公司；两步法PV6000试剂盒、DAB显色液、磷酸缓冲液(PBS)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 感觉测试仪购自IITC Life Science公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，冷冻切片机购自德国徕卡公司。

1.4 CCI-ION模型建立 模型的建立参考文献[11]。假手术组和手术组大鼠用10%的水合氯醛(剂量为300 mg/kg)腹腔注射麻醉，于右侧眉弓上行弧形切口以暴露眶下神经，用5-0号铬肠线间距约2 mm结扎眶下神经，假手术组只暴露眶下神经而不结扎，解剖显微镜下观察结扎效果，以未完全阻断神经传导并保证眶下神经外膜的血管轻度受压但血流畅通为宜。随后，用4-0号丝线缝合切口。

1.5 行为测试 将各组大鼠在术后每周用感觉测试仪测试机械痛域，刺激部位为触须部位及周围有毛皮肤，轻触甚至未有任何触碰大鼠表现出明显的退缩、攻击或搔脸行为时记录为痛阈值，每只大鼠刺激5次取平均值。

1.6 HE和免疫组化 以术后1～8周为时间点，每周处死假手术组和手术组大鼠各4只，手术组大鼠取手术侧及手术对侧TG；假手术组大鼠取手术侧TG。对照组大鼠取双侧TG。TG用4%多聚甲醛固定24 h，行常规石蜡切片(厚度4 μm)、HE染色和免疫组化染色。HE染色行形态学观察；以兔抗鼠P2Y1多克隆抗体(1∶1000)为一抗室温孵育2 h，以HPR标记的鼠抗兔二抗(1∶1000)37℃孵育1 h后，DAB显色液显色。倒置显微镜下计数阳性细胞数，随机观察5个视野/玻片。用Olympus倒置显微镜图像分析软件分析每张切片随机选择的5个视野的光密度值，取其平均光密度值反映P2Y1受体染色强度，光密度值越高，则阳性反应越强。

2 结果

2.1 CCI-ION大鼠的行为学变化 与对照组相比，自术后第1周发现CCI-ION组大鼠开始出现痛觉超敏现象(P<0.01)，表明CCI-ION大鼠疼痛阈值降低，如图1所示。

** 与对照组相比，P<0.01；## 与假手术组相比，P<0.01。

图1 CCI-ION大鼠缩足反射阈值变化

2.2 TG神经元的形态学变化 对照组神经元胞膜完整、胞核大小和形态未见异常、核仁清晰、轴突排列平行且密度均匀(图2A)。术后1～2周，CCI-ION大鼠可见TG中的神经元轴突稀疏、髓鞘增粗并出现节段性脱失(图2B)；术后3～5周可见TG中的神经元染色不均、出现明显的髓鞘迂曲、肿胀、节段性髓鞘脱失现象(图2C)；术后6～8周，TG中的神经元仍存在脱髓鞘、纤维迂曲、肿胀等现象，但情况较之前略有改善(图2D)。

A：正常对照组；B：术后第1周；C：术后第4周；D：术后第8周。

图2 术后TG中的神经元形态学改变(HE染色)

2.3 TG神经元中P2Y1受体阳性神经元检测 免疫组化检测发现，手术侧、假手术组及手术对侧在术后1周、4周和8周各组的TG中均存在P2Y1受体免疫反应阳性细胞(图3)。

图3 术后各组TG神经元P2YI受体免疫组化检测

2.4 P2Y1表达阳性细胞率及时序变化 术后4周，CCI-ION大鼠TG手术侧P2Y1受体阳性细胞达到顶峰(38±5)个，随后有所回落，但仍多于对照组(12±1) 个(F=43.27，P<0.001)(图4A)；与假手术组相比，术后第2周开始CCI-ION大鼠手术侧P2Y1受体免疫反应阳性细胞数量增多，第4周达高峰后有所回落，但仍高于假手术组(F=35.74，P<0.01，图5A)。与手术对侧相比[分别为(18±3)个、(25±2)个和(21±2)个]，CCI-ION术后第1、3、6周，手术侧P2Y1受体免疫反应阳性细胞数[分别为(18±2)个、(27±4)个和(26±2)个]未见升高，差异无统计学意义(F=0.70，P>0.05)，而其他时间节点均升高(F=30.25，P<0.05或P<0.01)(图6A)。

CCI-ION大鼠手术侧P2Y1受体免疫反应平均光密度值(AOD)在术后1～2周高于对照组和假手术侧，并随时间延长出现波动，但仍高于对照组(图4B)；与假手术组相比，手术侧P2Y1受体平均光密度变化也具有类似的表达趋势(图5B)。而与手术对侧相比，CCI-ION术后1～3周，手术侧的P2Y1受体平均光密度升高，自第4周后这种差异随之消失(图6B)。

A:手术侧和对照组P2Y1受体阳性细胞数；B：手术侧和对照组P2Y1受体平均光密度值；与对照组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图4 CCI-ION术后手术侧和对照组P2Y1受体阳性细胞数和平均光密度分析

A:手术侧和假手术组P2Y1受体阳性细胞数；B：手术侧和假手术组P2Y1受体平均光密度值与假手术组对应的时间节点相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图5 CCI-ION术后手术侧和假手术组P2Y1受体阳性细胞数和平均光密度分析

A:手术侧和手术对侧P2Y1受体阳性细胞数；B：手术侧和手术对侧P2Y1受体平均光密度值与手术对侧对应的时间节点相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图6 CCI-ION术后手术侧和手术对侧P2Y1受体阳性细胞数和平均光密度分析

3 讨论

P2Y1受体是ATP结合受体之一，在三叉神经节的传入神经元中高水平表达[12]。P2Y1受体对正常的热敏感性是必须的[12-13]，也参与了神经性疼痛以及福尔马林诱导的炎性痛[14-15]。但对于P2Y1受体在TN过程中的时序表达情况尚不清楚。

已有研究证实，CCI-ION模型大鼠的神经元髓鞘释放ATP，导致神经元活化并产生神经性疼痛[16]。本研究对模型大鼠的行为学观察表明，与对照组相比，CCI-ION模型大鼠表现为痛觉超敏现象。形态学观察结果显示，术后1～2周，CCI-ION大鼠TG中的神经元出现轴突稀疏、髓鞘增粗等，而术后3～5周可见明显的髓鞘肿胀和阶段性脱失现象。随后上述现象有所改善。检测该受体的表达发现，与对照组和假手术组相比，手术侧P2Y1受体的表达在术后1～4周升高，随后逐渐下降，这可能是手术急性损伤造成的急性炎症所致，随后随着炎症消退以及TG自我修复而有所改善，但表达水平仍高于对照组和假手术组，说明P2Y1受体可能在TN的介导中具有一定的作用。与手术对侧相比，虽然术后1、3、6周，手术侧P2Y1受体免疫反应阳性细胞数无显著变化，但在其他几周中手术侧P2Y1受体的表达出现明显波动，提示手术对侧P2Y1受体的表达在这几周升高，这说明P2Y1可能与TN阵发性发作存在关联，导致对侧TG神经元发生了痛觉敏感和炎性反应。而术后第4周手术对侧P2Y1受体阳性细胞数增加，但受体表达量未见显著升高，提示术后痛觉的神经传导对对侧TG产生了影响从而导致对侧TG内P2Y1受体的上调，但详细机制有待进一步研究。

综上所述，P2Y1可能参与了TN的诱发、痛觉传递等发病过程，但其具体机制需进一步深入研究。