针药结合对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区ChAT、AChE表达的影响

孔海龙，韦 旭，周 倩，黄 锐，马同军

(皖南医学院 1．临床医学院;2．人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)以渐进性学习记忆及认知功能障碍、人格改变和语言障碍等为主要临床表现。AD致死率仅次于癌症、心血管疾病和脑血管疾病，已发展成为引起老年患者死亡的“第四大杀手”[1]。目前对于AD西医治疗尚无特效方法，而我国中医的针刺方法在治疗该疾病过程中显示出较好的疗效[2]。天麻素为兰科多年生草本植物天麻干燥块茎的有效成分，具有健脑增智、镇静安神和治疗失眠的作用，对治疗AD疗效明显[3]。关于电针结合天麻素对AD大鼠海马CA1区的表达情况国内外尚未见报道。本实验采用腹腔注射D-半乳糖联合Aβ1-40海马注射的方法制备AD模型，通过观察电针结合天麻素对AD大鼠海马CA1区乙酰胆碱转移酶(acetylcholine transferase，ChAT)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)表达的变化，为探讨电针结合天麻素治疗AD大鼠的作用机制提供一定的形态学资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 60只SD雄性大鼠，体质量200～250 g，购买于浙江省实验动物中心，合格证号为SCXK(浙)-2014-0001。将60只SD大鼠随机分为6组:正常对照组、生理盐水组、模型组、电针组、天麻素组、针药结合组，每组10只。

1.2 主要试剂和仪器 Aβ1-40、D-半乳糖(Sigma公司)，天麻素注射液(规格5 mL∶500 mg，西南药业股份有限公司)，SABC染色试剂盒、兔抗AChE、兔抗ChAT、DAB显色剂(武汉博士德公司)，华佗牌SDZ-II型电子针疗仪(上海医用电子仪器厂)，华佗牌无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)，江湾Ⅰ型鼠脑立体定向仪。

1.3 动物模型的建立 参照文献[4]建立动物模型。将Aβ1-40用前在37℃恒温箱中孵育1周，使其凝聚老化，备用。模型组、电针组、天麻素组、针药结合组4组大鼠按120 mg/(kg·d)腹腔注射D-半乳糖，连续8周；生理盐水组大鼠腹腔注射等量生理盐水，连续8周；正常对照组大鼠不做任何处理。模型组、电针组、天麻素组、针药结合组大鼠在D-半乳糖连续处理8周后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，参照文献[5]和大鼠脑立体定位图谱以前囟后3.5 mm，正中线旁开2.0 mm，深度2.8 mm，双侧海马注射Aβ1-40。生理盐水组腹腔注射等量生理盐水且于双侧海马注射等量生理盐水2 μL。正常对照组大鼠不做任何处理。

1.4 治疗方法 电针组与针药结合组按《大鼠穴位图谱的研制》标准选取“百会”、“大椎”、“足三里”穴，频率2 Hz，强度3V，每次30 min，每日1次，电针4周。天麻素组与电针结合天麻素组将天麻素注射液(5 mL∶500 mg)按10 mg/kg腹腔注射，每日1次，连续4周。

1.5 免疫组织化学染色 治疗结束后以10%水合氯醛麻醉，经左心室快速滴注生理盐水，取脑，置于4%多聚甲醛液中固定24 h，依次脱水透明后制成蜡块。取海马连续冠状切片，片厚5 μm。按SABC法试剂说明书进行染色，封片。每组取海马切片各20张(每只随机选取2张)，统计400倍视野下海马CA1区ChAT与AChE阳性神经元数量。

1.6 统计学处理 用SPSS 18.0软件进行统计分析，数值变量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马CA1区ChAT的表达 ChAT阳性神经元呈空泡状，棕色或棕黄色，着色部位主要位于胞质和胞膜。与正常对照组、生理盐水组比较，模型组大鼠海马CA1区的ChAT阳性神经元数量减少(P<0.05)；与模型组比较，电针组和天麻素组大鼠海马CA1区的ChAT阳性神经元数量增多(P<0.05)；与电针组和天麻素组比较，针药结合组大鼠海马CA1区的ChAT阳性神经元数量增多(P<0.05)，见图1，表1。

A.正常对照组；B.生理盐水组；C.模型组；D.电针组；E.天麻素组；F.针药结合组。

图1 各组大鼠海马CA1区ChAT表达

2.2 海马CA1区AChE的表达 AChE阳性神经元呈空泡状，棕色或棕黄色，着色部位主要位于胞浆和胞膜。与正常对照组、生理盐水组比较，模型组大鼠海马CA1区的AChE阳性神经元数量增多(P<0.05)；与模型组比较，电针组和天麻素组大鼠海马CA1区的AChE阳性神经元数量减少(P<0.05)；与电针组和天麻素组比较，针药结合组大鼠海马CA1区的AChE阳性神经元数量减少(P<0.05)，见图2，表1。

A.正常对照组；B.生理盐水组；C.模型组；D.电针组；E.天麻素组；F.针药结合组。

图2 各组大鼠海马CA1区AChE表达

组别ChATAChE正常对照组67.20±9.1950.50±8.71生理盐水组66.10±6.3551.20±5.85模型组40.90±3.87∗73.90±7.72∗电针组50.50±4.60∗△▲66.00±6.68∗△▲天麻素组49.00±6.36∗△▲66.30±9.07∗△▲针药结合组56.40±5.97∗△58.70±4.50∗△F26.79716.327P0.0000.000

注：与正常对照组或生理盐水组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与针药结合组比较，▲P<0.05。

3 讨论

脑内胆碱能系统在学习记忆方面起着重要作用，乙酰胆碱(Ach)是迄今为止发现的与学习记忆密切相关的一种递质，随着人体机体的老化，脑组织中Ach含量明显减少，Ach含量的降低将加速脑细胞的衰亡，使记忆力下降，进而可诱发AD[6]。脑内Ach的含量取决于Ach生成与水解的平衡，而AChE和ChAT是中枢胆碱能系统特异性酶，与脑内Ach的含量密切相关。AChE是Ach的水解酶，ChAT是Ach合成的限速酶。AChE在胆碱能神经元的突触、胞体中含量较多，胆碱能神经元的活性可由AChE的含量来体现，是反映脑内胆碱能神经系统功能的重要标志酶[7]。ChAT产生于胆碱能神经元的胞体内，与Ach在脑内的分布平行，是反映Ach含量的重要指标[8]。AD发生时，海马内的胆碱能神经元大量变性丢失，使得脑内ChAT活性降低，造成Ach的合成、释放和储存减少，进而导致以记忆和认知障碍为主的多种临床表现的发生[9]。

中医认为AD发病部位在脑，以髓海空虚、神机失用为根本病因[10]。百会属督脉，有升阳举陷、开窍醒脑之功效[11]。大椎穴为督脉之腧穴，统领诸阳经，为调整全身机能的要穴。足三里为胃经合穴，有升精降浊，导痰行滞之功效[12]。有研究[13]表明电针可明显改善AD患者的学习记忆功能，有效率可达到83.33%。电针可通过修复受损神经元突触，重新构建神经元网络连接，从而达到防治AD的作用[14]。天麻素又名天麻甙，对失眠、焦虑和神经衰弱等症状有缓解作用，能够减轻AD模型脑内炎症并可提高学习记忆能力[15]。AChE和ChAT是Ach分解与合成的两个重要的特异性酶，而天麻素可通过调节AChE或ChAT的活性发挥胆碱能效应，增强神经突触兴奋性，从而提高学习记忆的能力[16]。

本实验选取“百会”、“大椎”、“足三里”穴，对AD大鼠进行电针结合天麻素治疗，并通过免疫组织化学方法观察AD大鼠大脑海马CA1区AChE和ChAT的变化。结果显示模型组大鼠海马CA1区AChE的表达高于正常对照组和生理盐水组，ChAT的表达低于正常对照组和生理盐水组，提示模型组大鼠海马CA1区内胆碱能神经元可能受到损伤和破坏。治疗后电针组与天麻素组大鼠海马CA1区AChE的表达降低，ChAT的表达增高，以针药结合组的表达最为显著，提示电针结合天麻素具有显著的增效作用，这可能通过抑制AChE和上调ChAT的表达，修复受损胆碱能神经元，调节Ach的生理代谢，从而达到治疗AD的作用。