大鼠纤维环干细胞的分离与鉴定

金中行，徐宏光，张 玙，刘 晨，肖 良，王 效，沈 阳

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 脊柱外科，安徽 芜湖 241001)

椎间盘退变是一种常见疾病，研究人员将关注点集中在髓核退变上，发现纤维环在吸收震荡和保持髓核组织形态上发挥了重要作用[1]。如何防止纤维环的退变是研究人员关心的问题。有报道表明，术中显微内窥镜下行纤维环修复可得到较好的疗效[2]，对症治疗虽可即刻缓解患者的临床症状，但不可避免地会改变脊柱的正常生理结构，日后很可能会出现邻近节段退变、继发性脊柱不稳等一系列问题，利用组织工程技术重建纤维环结构可能成为比较理想的治疗方式。

体外获取充足的活性较强的纤维环种子细胞对此项技术具有重要意义。已有研究表明，可以从人纤维环组织分离出纤维环干细胞[3]，但存在取材困难，退变纤维环提取出的干细胞活力较差等问题。本研究应用单细胞克隆法从大鼠尾椎椎间盘组织分离纯化纤维环源干细胞，具有取材方便，干细胞纯度高以及细胞数量丰富等优势，为后续研究纤维环干细胞特征建立了体外模型。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料 0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%二型胶原酶(Sigma),磷酸盐缓冲液(PBS)(SH30256.01,hyclone),青霉素-链霉素溶液(15070063，Gibco)，DMEM/F12培养基(Gibco),干细胞胎牛血清(Gibco)，干细胞成骨分化诱导培养基(A1007201，Gibco)，干细胞成脂肪分化诱导培养基(A1007001，Gibco)，干细胞成软骨分化诱导培养基(A1007101，Gibco)，茜素红染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)，油红O染色剂(O 0625，Sigma),番红染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)，0.1%结晶紫染色剂(C8407，索莱宝)，4%多聚甲醛固定液，10 cm培养皿和T24培养瓶(Corning)。

1.2 标本选取 选取4周龄SD大鼠10只，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后颈椎脱臼法处死，在含有75%酒精的烧瓶中浸泡消毒4 min，在无菌工作台上撕脱大鼠尾椎皮肤，用剪刀离断尾椎，分离其中的椎间盘，用尖刀片去掉其中的髓核组织，将所得纤维环组织浸泡在含有1%青霉素-链霉素的PBS液的培养皿中。

1.3 纤维环干细胞的分离纯化和培养 将新鲜纤维环组织用含有1%青霉素-链霉素的PBS液，冲洗至透明，眼科剪将组织修剪为1 mm3大小的组织块，PBS液冲洗干净，以100 U/mL的胶原酶和16 U/mL的透明质酸酶在磁力搅拌条件下消化3～5 h，至组织块逐渐消失。消化物用筛网过滤。过滤后的液体以800 r/min低速离心5 min，弃上清液；用DMEM培养液冲洗，800 r/min低速离心5 min，重复3 次。以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液吹打混匀，细胞悬液以50、100、200个/ cm2接种于10 cm培养皿。每2天换1 次液，待细胞80%融合时，用0.25%胰蛋白酶溶液进行传代用以后续实验，按培养面积1∶3 的比例接种于24 孔板中。

1.4 纤维环干细胞鉴定

1.4.1 单克隆细胞集落形成分析 以50、100、200个/cm2不同密度接种的原代细胞培养8～10 d后，倒置显微镜下观察细胞集落形成单位，不同密度接种的培养皿各取3份，分成3组，吸去培养基，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS液清洗3次后滴加0.1%结晶紫染剂，染色15 min后PBS溶液轻缓冲洗3次，随后肉眼观察集落形态和数目。

1.4.2 成骨诱导分化和染色 选择接种在24孔板中的第2代大鼠纤维环源干细胞，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培养基作为基础培养基，培养至细胞融合80%时，吸去基础培养基，加入成骨诱导液，每隔3 d换液，持续培养21 d，正常培养基培养作为阴性对照组。移去诱导液，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS液清洗3次，移去液体加入茜素红染剂，室温放置1 h,弃去染色剂，PBS液清洗3次后倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4.3 成软骨诱导分化和染色 选择接种在24孔板中的第2代大鼠纤维环源干细胞，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培养基作为基础培养基，培养至细胞融合80%时，吸去培养基，加入成软骨诱导液，每隔3 d换液，持续培养21 d，正常培养基培养作为阴性对照组。移去诱导液，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS液清洗3次，弃上清加入番红染色剂,室温放置1 h,弃去染色剂，PBS液清洗3次后倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4.4 成脂肪诱导分化和染色 选择接种在24孔板中的第2代大鼠纤维环源干细胞，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培养基作为基础培养基，培养至细胞融合80%时，吸去培养基，加入成脂肪诱导液，每隔3 d换液，持续培养12 d，正常培养基培养作为阴性对照组。移去诱导液，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS液清洗3次，移去液体加入油红O染色剂,室温放置1 h，弃去染色剂，PBS液清洗3次后倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

2 结果

2.1 纤维环干细胞集落形成能力观察 倒置显微镜下观察成纤维细胞集落生成单位，判断干细胞集落生成能力。大鼠纤维环源细胞以低密度接种于培养皿中，8～10 d后可在倒置显微镜下明显观察到单克隆来源的细胞集落形成(图1)。

图1 大鼠纤维环干细胞单克隆细胞集落

2.2 结晶紫染色观察 原代细胞接种密度的差异会导致干细胞集落生成能力的不同。0.1%结晶紫液染色15 min,PBS液缓慢清洗多次，肉眼观察可见，3组培养皿中均可见遍布皿底的蓝紫色类圆型细胞集落，200个/cm2密度接种的细胞集落密度最大，细胞集落形成数目与接种密度呈正相关(图2)。

A.50个/cm2密度接种；B.100个/cm2密度接种；C.200个/cm2密度接种。

图2 结晶紫染色观察

2.3 纤维环干细胞的三系诱导分化结果 通过对纤维环源干细胞成脂，成骨和成软骨诱导分化后染色，鉴定其多向分化潜能(图3)。成骨诱导染色倒置显微镜下可见视野内大量红染的钙结节形成。对照组未见明显钙结节形成(图3A)。成脂诱导染色倒置显微镜下可见细胞内外有大量红染脂滴形成。对照组未见明显脂滴形成(图3B)。成软骨诱导染色倒置显微镜下可见视野内类圆形软骨样细胞形成，周围聚集红染的软骨细胞特异性分泌的聚集蛋白聚糖。对照组未见明显红染区域(图3C)。

A.成骨诱导21 d后，细胞周围红染钙结节形成，对照组未见染色区域。B.成脂诱导12 d后，细胞内外聚集有红染脂滴形成，对照未见明显染色。C.成软骨诱导21 d后，广泛可见红染聚集蛋白聚糖形成，对照组未见红染区域。

图3 大鼠纤维环干细胞的三系诱导分化染色

3 讨论

制备体外纤维环组织有两大必备因素：种子细胞和仿生支架。理想的种子细胞常被认为是自体纤维环细胞，但是体外细胞培养实验表明，纤维环细胞随着传代的进行，细胞活力会逐渐丧失[4]，分泌胞外基质的能力也逐渐下降，同时，获取人纤维环细胞比较困难且细胞数量有限。间充质干细胞来源广泛，骨髓和脂肪等组织均含有较丰富的间充质干细胞，常被作为组织工程种子细胞[5]。给予适宜生长的微环境，骨髓间充质干细胞可分化为类髓核样细胞[6]，也可在体外纤维环支架上分化为成纤维样细胞[7]，但同时有研究表明，不同来源组织的间充质干细胞定向分化潜能并不一致，滑膜来源的间充质干细胞趋向于分化软骨细胞，脂肪来源干细胞的成脂能力更强[8]。因此我们认为纤维环来源干细胞更适合成为纤维环组织工程的种子细胞。相较于大鼠腰椎，取材大鼠尾椎避免腰椎后入路必要的肌肉剥离，简化了操作时间，实验证明尾椎所提取的原代细胞，活力丰富，增殖能力较强[9]。

纤维环干细胞的获取来之不易，纯化和分离纤维环干细胞已然非常必要，流式细胞分选法和免疫磁珠分选技术作为间充质干细胞筛选法[10]，已被人们熟知，具有可分选细胞数量巨大，分选细胞纯度高等优点，但操作过程中也不可避免地会对细胞活力造成影响。采用微孔板单克隆培养法，是基于干细胞具有体外单克隆集落形成能力，有研究表明，脂肪来源基质干细胞可通过单克隆培养法获得纯系干细胞集落[11]，本研究运用微孔板单克隆细胞培养法，倒置显微镜下观察可发现集落内细胞形态均一，低密度细胞接种过程中，干细胞群体逐渐表现出增殖优势，筛选出纯度较高的干细胞集落，且增殖能力较强，故此方法对细胞活力并无较大影响，证实了微孔板单克隆培养法的可行性，为后续研究提供了可靠的体外细胞模型和可靠的分离纯化纤维环干细胞的方法。