人腋窝毛乳头细胞的分离与培养

黄春玲 余南岚 熊亚 张东梅 杨希川

400038重庆，陆军军医大学第一附属医院皮肤科

毛乳头位于毛囊底部的毛球中，是一种特殊的间质成分，胚胎时期诱导毛囊发生发育，出生后在毛囊的周期性生长过程中起重要作用［1-3］。因此，体外分离培养毛乳头细胞（dermal papilla cells，DPC）对于研究DPC的特性、生物学功能、毛囊发育与再生等均有重要意义［4-6］。不同部位DPC有各自的生物学特性［7-8］。目前已报道人头皮、阴部和胎儿DPC，及大鼠触须、背部DPC和西藏小型猪DPC的分离培养方法，尚无人腋窝DPC的高效快速分离方法的报道。我们改良建立一种简单、高效、易操作且适合腋窝DPC分离培养的方法，并与一步酶消化法和显微解剖法比较，为进一步研究毛囊提供细胞来源。

一、材料

1.主要试剂：胎牛血清、DMEM培养基（美国Hyclone公司），0.5%分离蛋白酶（Dispase）和0.2%Ⅰ型胶原酶（美国Sigma公司）。一抗鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体、Ⅳ型胶原多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），二抗3H-吲哚菁类染料（cy3）标记的羊抗鼠抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。

2.标本来源及处理：标本来自2015年10月至2016年5月陆军军医大学第一附属医院皮肤科腋臭术后含毛囊的皮肤组织，大小为0.5 cm×2 cm～1 cm×4 cm，采集后立即置于4℃无菌D-hanks液中保存，保存时间＜24 h。将标本分为3组，分别用改良二步酶消化法、一步酶消化法、显微解剖分离法分离毛乳头，每组3份。

二、方法

1.标本消毒：将标本置于干净培养皿中，放入75%乙醇浸泡2遍，每次5 min，用无菌D-hanks液漂洗5次后移入无菌培养皿中。

2.毛乳头分离：3种方法操作过程比较见表1。

改良二步酶消化法［9］：①用镊子去除多余的皮下脂肪组织，尽量去除毛囊单位周围的组织，直至显露毛球部，分离出单个毛囊，用眼科剪将毛球部剪下，将收集到的毛球转入干净的含有分离酶的培养皿中，4℃消化4～6 h，再37℃消化30 min；②将标本在D-hanks液中漂洗2遍后加入0.2%胶原酶37℃消化1.5～2 h，此后每30分钟观察毛乳头游离情况，当有毛乳头游出时立即加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM终止消化；③将液体移入离心管离心（2 000×g，5 min），弃上清液，沉淀即为毛乳头、残发、纤维组织及其他细胞的混合物，将沉淀移入平皿中用DMEM反复漂洗，倒置显微镜下将纤维组织和残发及其余杂质去掉。洗脱液继续低速离心（500×g，3 min）4次，轻弃上清液，取沉淀加含10%胎牛血清的培养基于37℃、5%CO2培养箱培养。

一步酶消化法：参照文献［10］的方法分离。

显微解剖分离法：参照文献［11］的方法，用显微解剖法得到完整毛乳头，再加入Ⅰ型胶原酶（2 g/L，DMEM配制）37℃消化30 min后培养。

3.毛乳头细胞培养：将通过3种分离方法获得的毛乳头用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。计算腋窝毛乳头分离效率（分离出的毛乳头个数/总毛囊数×100%）、贴壁率（贴壁毛乳头个数/分离出的毛乳头个数×100%），并观察细胞迁出时间（从第1个毛乳头有细胞迁出至所有毛乳头不再有细胞迁出）。同时将改良二步酶消化法离心过程中的上清液进行培养。

4.毛乳头细胞传代：待细胞完全迁出后及时传代，去掉原培养液，加入少量PBS中和残余血清，移去中和液后再加入1 ml胰酶，室温消化1～2 min，倒置显微镜下可见上层细胞变圆，底层细胞仍为长条形。再消化3 min，弃掉胰酶后加入含10%胎牛血清的培养液，用吸管吹打至细胞完全脱落形成单细胞，可按1∶3比例传代。

5.毛乳头细胞鉴定：取第3代毛乳头细胞，按每皿1×105个将细胞接种在激光共聚焦小皿上，37℃、5%CO2过夜培养，PBS冲洗2遍，4%甲醛室温下固定10 min，PBS洗1遍，1%Triton100作用10 min，PBS缓冲液漂洗，山羊血清封闭20 min，弃去血清，滴加一抗，4℃冰箱过夜后PBS漂洗，滴加二抗，37℃下孵育20 min，PBS冲洗，RNase作用10 min，PBS漂洗，碘化丙锭复染核，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

三、结果

1.毛乳头分离：上述3种方法分离得到的腋窝毛乳头镜下均呈锥形，大小与毛囊大小及直径有关。改良二步酶消化法得到的毛乳头干净，真皮鞘残留少（图1A）；一步酶消化法得到的毛乳头形态大多比较完整（图1B）；显微解剖法得到的毛乳头形态完整，可见残留真皮鞘（图1C）。毛乳头分离效率比较见表1。

2.毛乳头细胞培养：改良二步酶消化法分离出的毛乳头接种24 h后33%贴壁，1周后贴壁率达到96%。贴壁的毛乳头2 d后即有细胞迁出，刚迁出的细胞多呈三角形或短梭形，细胞质丰富，细胞体积较大，随细胞增殖呈多层聚集生长现象（图2A）。一步酶消化法和显微解剖法分离的毛乳头细胞迁出较改良二步酶消化法慢（图2B、2C），细胞形态和其他特性都相同。毛乳头贴壁和细胞迁出情况比较见表1。对改良二步酶消化法消化过程中产生的悬浮细胞进行培养，未见细胞贴壁或生长。

3.毛乳头细胞传代：用上述方法传代后第2天即可见细胞贴壁展开，传代后的毛乳头细胞逐渐重新倾向凝集性生长，随着时间的增加，凝集生长现象逐渐明显，但随着传代次数增加，凝集性生长现象逐渐消失，6代以后基本不再出现凝集性生长现象（图3）。

图1 3种方法分离得到的腋窝毛乳头

图2 3种方法分离得到的毛乳头细胞迁出情况（×40）

表1 3种方法分离毛乳头及毛乳头细胞培养结果对比

图3 改良二步酶消化法分离得到的腋窝毛乳头细胞生长情况

图4 改良二步酶消化法分离得到的腋窝毛乳头细胞鉴定（免疫荧光×400）

4.免疫荧光结果：腋窝毛乳头细胞层黏连蛋白和Ⅳ型胶原皆呈阳性表达（图4）。

四、讨论

毛乳头细胞最为显著的功能是诱导毛囊形成，其功能异常是导致毛囊周期失衡和脱发的主要起始因素，因此体外分离培养DPC是研究毛囊的前提和基础。头皮标本来源有限，不便收集，腋窝与头皮DPC在结构和功能上相近，是研究毛囊更好的细胞来源。腋窝标本易于收集，因此分离培养腋窝DPC具有重要的意义。

目前DPC的分离方法主要分为显微解剖法和酶消化法，显微解剖法需要特殊的体视显微镜，普通实验室难以具备，并且技术要求高，难以广泛开展。酶消化法简便、快速，但标本需求量大，实际工作中难以保证充足的标本来源。腋窝标本组织皮下脂肪厚，毛囊密度稀疏，传统方法不便分离。我们在已建立的改良二步酶消化法基础上，改良建立了一种简单、高效、易操作、适合腋窝DPC分离培养的方法，先粗分离出单个毛囊，分离毛囊后切下毛球部进行消化，尽量去除毛囊单位周围的脂肪、胶原和结缔组织，有利于消化。胶原酶能够最大限度地消化毛干和上皮细胞，未消化的易被捡出，在倒置显微镜下还能用眼科镊将被纤维组织等缠绕的毛乳头释放出来，减少毛乳头的损失。此改良方法拥有显微解剖法标本利用率高、毛乳头损失少和酶消化法操作简单、技术要求低的优点，且比一步酶消化法消化效果好，提高了细胞分离纯度，减少了杂质，是一种较理想的分离培养腋窝DPC的方法，具有推广应用价值。