过量硒加重二硝基氯苯诱导的小鼠特应性皮炎样表现

莫俊銮 张丽君 周继昌 龚春梅 徐远飞 杨慧

518020深圳市慢性病防治中心分子生物学实验室

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是慢性复发性皮肤病，发病机制尚不清楚，有研究认为，异常免疫反应是其发病机制之一，而免疫调节失衡在AD疾病进展中起重要作用。硒（selenium，Se）是人体必需的微量元素，它在减轻氧化应激，调节中性粒细胞、NK细胞、B淋巴细胞和T细胞功能，以及改善免疫状态和抗炎作用方面发挥作用［1］。我们将AD免疫学特点和硒生物学功能结合，设计膳食硒干预二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）致敏诱导的AD样小鼠实验，观察膳食硒水平对小鼠AD样表现的影响。

材料和方法

一、材料

40只SPF级BALB/c小鼠来自广东省医学实验动物中心，合格证号44007200001631、44007200001820，许可证号SCXK（粤）2008-0002，3周龄，雌性，体重（10±1）g。硒饲料来自美国Harland Teklad公司，硒含量分别为0.01、0.25和3.00 mg/kg。DNCB来自美国Sigma公司。鼠IgE ELISA试剂盒来自中国台湾Abnova公司。Multiskan FC酶标仪来自美国Thermo公司。7700 X电感耦合等离子体质谱仪来自美国Agilent公司。

二、方法

1.膳食硒干预和致敏刺激动物实验：40只小鼠随机分为缺硒组（日粮硒含量0.01 mg/kg）、正常硒组（0.25 mg/kg）、过量硒组（3.00 mg/kg）和对照组（0.25 mg/kg）［2］。所有小鼠先缺硒饲料饲养4周，再分别以缺硒、正常硒、过量硒和正常硒饲料喂养4周。随后对缺硒、正常硒和过量硒组用致敏原（DNCB橄榄油丙酮溶液）激发AD样表现，对照组用空白基质溶液涂抹。激发方法在参照文献［3］基础上进行优化：激发前24 h剃掉小鼠背部毛发（6～8 cm2面积），观察24 h内剃毛部位有无皮损和炎症发生。按4∶1配制橄榄油和丙酮混合溶液，以此为基质溶液配制质量浓度为1%和0.1%的DNCB致敏溶液。前3天每天用200 μl的1%DNCB溶液涂擦DNCB组小鼠背部皮肤1次，第4天开始用0.1%DNCB涂抹背部皮肤，每周3次，共激发3周。对照组使用基质液，频率同致敏组。激发期间继续按方案干预膳食硒水平。

2.小鼠皮炎表现监测：每天观察小鼠一般健康状况和进食情况，每次涂液前观察皮肤变化并拍照。根据以下4类表现评价皮炎严重程度［4］：出血/红斑，瘢痕/干燥，水肿，表皮脱落/侵蚀和苔藓样变。每种表现按照0（无）、1（轻度）、2（中度）和3（严重）评分，合计表现总评分。小鼠抓挠计数：在每次涂液1 h后，单独放置小鼠，观察小鼠5 min内搔抓耳部或背部的动作（不含小鼠擦嘴、舔毛的动作），使用机械按压式计数器计数，连续搔抓按1次计数［3，5］。

3.免疫、组织病理和理化分析：激发3周后，眼眶采血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集后4℃保存待检，1 h内上机（血细胞计数仪）分析全血炎症细胞。将上述EDTA抗凝血于4℃下1000×g离心15min获得血浆，ELISA法检测总IgE。脱颈处死小鼠，剪取小鼠背部实验部位皮肤，制备皮肤病理切片于显微镜下观察。每只小鼠选择4个切片，每个切片随机选择4个视野（×400）计数炎症细胞，结果取均值。称取0.3～0.5 g皮肤组织，采用ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）技术测定硒含量。

4.统计分析：IgE、硒水平和细胞计数等检测结果多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用T检验；IgE等检测指标与硒水平的相关性分析采用Pearson相关性分析和线性回归分析；数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同组小鼠皮肤表现比较

1.皮肤表现：致敏组（缺硒、正常硒和过量硒）小鼠在激发1周后均先后出现红斑、水肿、干燥、脱屑和苔藓样变，继而在挠抓部位出现丘疹、糜烂和结痂等皮炎表现。早期表现首先出现于缺硒组，而后依次是正常硒组和过量硒组，但后期皮损炎症在过量硒组最重，其次是正常硒组和缺硒组。致敏后期，过量硒组背部皮肤普遍出现因挠抓、撕咬导致的皮肤糜烂、出血和结痂情况。对照组皮肤无明显变化。见图1。

2.皮肤表现评分和抓挠次数：皮肤表现评分显示，致敏第6天后，致敏组（缺硒、正常硒、过量硒）小鼠皮炎表现严重程度明显高于对照组，差异有统计学意义（致敏第6、8、11、13、15、18天时各组间比较，F值分别为44.897、76.622、114.866、33.352、28.605、11.271，均P＜ 0.01），见图2A。致敏第11、13、15、18天时，过量硒组皮肤表现评分高于缺硒组和正常硒组，差异有统计学意义（均P＜0.05），缺硒组和正常硒组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。致敏第8天，致敏组小鼠抓挠次数明显高于对照组，差异有统计学意义（致敏第8、11、13、15、18天时各组间比较，F值分别为4.037、5.967、7.036、5.004、10.818，均P＜0.05）。致敏第13天，抓挠次数缺硒组＞正常硒组＞过量硒组，但组间差异无统计学意义（均P＞0.05），见图2B。

图1 各组小鼠皮肤表现变化

图2 小鼠皮炎表现严重程度评分和瘙痒的变化

二、皮损组织病理观察

1.病理表现：致敏小鼠表皮明显增厚，棘层细胞大量增生，并向外突起；皮肤结构分层不清晰，伴海绵水肿和结缔组织胶原变性，常见血管扩张充血和毛囊结构消失等改变。对照组小鼠皮肤正常（图3）。

2.皮肤组织中炎症细胞计数：见表1。皮肤组织中淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数在4组间差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05），其中3个致敏组均显著高于对照组，但3个致敏组之间炎症细胞计数差异无统计学意义。

三、全血炎症细胞计数

致敏组全血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞水平随硒水平增加而升高，见表1。其中过量硒组升高最明显，缺硒组最低。

四、血浆总IgE检测

见表1。与对照组相比，致敏组小鼠血浆总IgE均升高，且IgE水平随膳食硒水平的增加而升高，其中过量硒组升高最显著，与缺硒组、正常硒组和对照组比较,差异均有统计学意义（t值分别为3.919、3.222、6.485，均P＜ 0.05）。

五、皮炎相关检测指标与硒水平相关性分析

1.皮肤组织硒含量：如表1所示，小鼠皮损/涂液处皮肤组织硒含量随膳食硒水平增加而升高，各组间的差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.致敏小鼠主要检测指标与皮肤组织硒含量的相关性：Pearson相关分析发现，除全血单核细胞（r=0.289，P＞0.05）外，皮肤组织硒含量与血浆IgE水平（r=0.579，P=0.001）、全血白细胞（r=0.414，P=0.016）、中性粒细胞（r=0.439，P=0.011）、淋巴细胞（r=0.417，P=0.015）、嗜酸性粒细胞（r=0.505，P=0.004）和嗜碱性粒细胞（r=0.37，P=0.029）显著相关。线性回归分析显示，除全血嗜碱性粒细胞（P＞0.05）和单核细胞（P＞0.05）外，其他指标均与皮肤组织硒含量呈线性正相关（P＜0.05）。

图3 各组小鼠皮损组织病理（HE×40）

表1 各组小鼠皮肤组织硒含量及炎症指标检测结果（±s）

表1 各组小鼠皮肤组织硒含量及炎症指标检测结果（±s）

注：a与其他各组分别比较，均P＜0.05；b～e标记相同字母的两组之间同一指标比较，P＜0.05；f小鼠背部皮损或对照部位皮肤组织病理切片细胞计数，为4个随机视野（400倍）均值

检测项目皮肤组织硒含量（μg/kg）血浆总IgE（μg/L）皮肤淋巴细胞f（个/视野）皮肤中性粒细胞f（个/视野）皮肤嗜酸性粒细胞f（个/视野）全血白细胞（109/L）全血中性粒细胞（109/L）全血淋巴细胞（109/L）全血嗜酸性粒细胞（109/L）全血嗜碱性粒细胞（109/L）全血单核细胞（109/L）缺硒组（10只）65.56±13.1a 124.78±5.32 0.95±0.45b 2.05±0.97 2.30±1.59 3.03±0.97b c 0.12±0.05b c 2.07±0.58b c 0.12±0.13b 0.67±0.37b 0.05±0.07正常硒组（10只）200.80±51.6 132.61±4.71 1.65±0.42b 5.30±3.82b 3.10±2.02 4.58±0.95b d 0.19±0.05b d 3.78±0.87b d 0.17±0.12c 0.34±0.10b c 0.09±0.09过量硒组（10只）320.70±83.0a 167.17±8.49a 1.50±0.43 6.40±3.56b 4.15±2.00 9.20±5.89c e 0.45±0.33c e 6.71±4.28c e 0.63±0.46b c 1.22±0.84c 0.20±0.26对照组（10只）167.10±24.9 109.13±0.79a 0.05±0.11a 0.25±0.18a 0.00±0.00a 2.73±1.08d e 0.13±0.05d e 2.33±0.99d e 0.01±0.01a 0.20±0.08a 0.05±0.06 F值42.146 17.267 18.225 5.742 5.839 8.946 7.908 8.379 10.946 9.090 2.032 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

讨 论

本实验中致敏小鼠均出现典型皮炎表现，其中缺硒组表现出现最早，但皮损程度最轻，过量硒组表现出现最晚，却是皮损最严重的一组。进一步分析发现，致敏小鼠血浆总IgE水平和全血炎症细胞计数均随膳食硒水平的增加而升高并与小鼠皮肤组织硒含量呈线性正相关。这与既往研究结论有所不同。在一项关于硒与过敏性哮喘的动物实验研究中，相较于低硒（日粮硒0.08 mg/kg）组和高硒（1.0 mg/kg）组，中硒（0.25 mg/kg）组小鼠的过敏性哮喘更加严重［1］。而一项随机对照人体试验发现，没有证据能证明补充硒有益于特应性湿疹/皮炎的治疗［6］。事实上，硒是一把双刃剑，极度缺乏和过量都有可能有害［1］。当膳食硒缺乏（≤ 0.1 mg/kg）时，主要硒蛋白酶活性和mRNA水平明显受影响；但当硒水平增加8倍（0.8 mg/kg）后，主要硒蛋白的酶活性和mRNA水平均进入平台区［7］。在另一项研究中，小鼠在饲料硒含量为0～0.2 mg/kg时，其生长发育未受影响；当硒水平增加到2 mg/kg时，小鼠体重开始降低，并出现肝转录改变；而当硒含量达到5 mg/kg时，小鼠生长发育明显受影响并产生肝毒性［8］。本实验中，过量硒组（3 mg/kg）小鼠皮炎表现更严重，而缺硒组最轻，提示硒可能通过影响免疫反应水平导致过敏反应的程度差异，进而引起表现差异。

一般情况下，增加硒摄入量可以增强细胞免疫和体液免疫反应。然而，补充足够的硒水平以期获得额外的免疫保护的效果尚不确定［9］，特别是过敏性疾病。本研究中，摄入过量硒对小鼠AD不但没有保护作用，反而加重皮肤免疫损伤，产生更为严重的皮炎表现；而硒摄入缺乏则可能因免疫抑制而减轻皮肤损伤，这可能与AD的免疫反应特点有关。缺硒小鼠致敏时皮炎表现较正常硒组轻，可能因为硒缺乏抑制了法氏囊和胸腺的生长进而抑制了免疫功能，机体对致敏原的反应更低［10］。而过量硒组皮炎表现最为严重，可能与过量硒促进异常免疫反应，导致皮肤屏障缺陷从而引发更严重的皮炎有关［11］。

总之，微量营养素硒可能通过其生物学效应影响机体免疫反应水平，进而影响皮炎的严重程度，其在过敏性疾病中的作用需要进一步研究。