丹参酮I通过激活Nrf2-ARE通路阻抑放射性膀胱炎早期损伤的形成

彭 昆，高文强，邱雪峰，陈 蔚，张士伟，郭宏骞

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科，江苏南京 210008；2.南京大学泌尿外科学研究所，江苏南京 210008；3.东南大学医学院，江苏南京 210009)

盆腔恶性肿瘤如宫颈癌、直肠癌、前列腺癌及膀胱癌，放疗是部分早期肿瘤的一线治疗手段以及大部分的晚期肿瘤的重要姑息治疗手段。由于盆腔空间狭小，各脏器之间十分接近，大剂量的盆腔放射治疗容易导致严重的并发症，如放射性肠炎、放射性致性腺损伤、放射性膀胱炎等等[1-4]。出血性放射性膀胱炎是比较常见的并发症，急性期主要表现为膀胱内壁广泛炎症，慢性期主要表现为膀胱壁的纤维化以及弥漫性的出血[5-6]。现有的临床治疗无法有效逆转慢性期膀胱组织发生的病理改变[7-8]。有文献报道降低早期急性期损伤有助于减轻和缓解膀胱组织纤维化改变[5,9-10]。

虽然放射性损伤的相关机制尚未完全探明，但是已有文献证明氧化应激在各种组织的早期射线损伤中发挥了重要作用[5,9]。因此，在膀胱遭受放射性损伤早期，抗氧化应激治疗如清除和抑制氧自由基可以成为重要的预防以及治疗手段[11]。核因子 E2 相关因子(Nuclear-factor-E2-related factor，Nrf2)及抗氧化反应原件(antioxidant response element，ARE)信号通路Nrf2-ARE是机体内氧化应激损伤的防御性通路。研究表明，Nrf2-ARE 信号通路在细胞抗氧化应激损伤机制中发挥了举足轻重的作用，也提示我们 Nrf2-ARE 信号通路是抗氧化损伤治疗的一个重要靶点[12-14]。丹参酮I(Tanshinone I，T-1)是中药丹参根的乙醚提取物中的成份，具有高效的抗氧化作用。本实验室之前已进行相关实验证明丹参酮I对放射性膀胱炎有保护作用，但是作用的方式尚未明了[15]。有研究已经证明丹参酮I通过Nrf2-ARE通路在很多器官和组织氧化应激中起到了保护作用，如紫外线引起的皮肤损伤以及砷引起的肺损伤[16-17]。但是尚未有丹参酮I通过Nrf2-ARE通路对放射性膀胱炎的保护作用的研究报告。我们假设丹参酮I通过Nrf2-ARE 信号通路减轻射线早期引起的氧化应激，从而在放射性膀胱炎早期中起到保护作用。因此，实验设计通过体内和体外两部分探索T-1对放射性膀胱炎早期保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养及分组人膀胱上皮永生化细胞(SV-40 immortalized human bladder cells,SV-HUC-1)购买自中科院细胞库，接种于含12%胎牛血清(美国 HyClone 公司)的高糖DMEM/F12(美国 Gibico公司)培养基中，培养条件为5% CO2、37 ℃。当细胞密度达到80%～90% 时，0.25% 胰酶消化完全后吹打离心，以1∶2进行传代培养。SV-HUC-1细胞接种于96孔板(约5 000个/孔)分为以下4组：对照组(Control)不进行任何处理，T-1处理组(T-1)仅用丹参酮Ⅰ(3 μmol/L，美国 Sigma 公司)处理48 h，X-射线照射组(X-ray)利用直线加速器(西门子，6-MV X射线，2 Gy/min)模拟放射性损伤(剂量为10 Gy)，T-1治疗组(X-ray+T-1)接受X射线照射后丹参酮Ⅰ处理48 h。

1.2方法

1.2.1细胞活力测定 使用CCK-8试剂盒(Vazyme Biotech，中国南京)，将SV-HUC-1细胞接种于96孔板(5000个/孔)，按上述分组处理后48 h，加入含10% CCK-8试剂的培养基100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，在450 mm测量波长及630 mmm修正波长下检测各组吸光度(A)值测定细胞活力。

1.2.2细胞内活性氧水平检测 使用活性氧检测试剂盒(美国Sigma 公司)，将SV-HUC-1细胞接种于6孔板，按上述“细胞培养及分组”方法随机分组并予以相应处理，48 h后去除培养基，用无血清培养基清洗2遍，加入1/1 000稀释的DCFH-DA荧光试剂，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育20 min，用无血清培养基洗净游离的DCFH-DA，在激发波长为502 mm，发射波长530 mm，以荧光显微镜观测7′-二氯荧光素(7′-Dichlorofluorescein,DCF)荧光，绿色荧光反应了细胞内活性氧水平。使用image-pro Plus 6.0 进行半自动化定量分析，测量积分度(IA)和面积(area)，计算出平均度。

1.2.3动物实验与分组 ICR雌性小鼠(20～25 g，购买自南京医科大学动物中心)随机分为如下4组：对照组(Control)10只，T-1处理组(T-1)10只，X-射线照射组(X-ray)10只，T-1治疗组(X-ray+T-1)10只。T-1处理组和T-1治疗组予以腹腔注射T-1 10 d，剂量为10 mg/(kg·48 h)，丹参酮I溶于橄榄油中，对照组和X-射线照射组腹腔注射相同剂量的橄榄油[16,18]。之后X-射线照射组和T-1治疗组予以X线盆腔照射，照射后继续按照之前方案腹腔注射丹参酮I或橄榄油，X线照射3 d和7 d后各处死5只小鼠，留取膀胱组织进行后续实验。

1.2.4小鼠放射性膀胱炎模型 使用氯胺酮(100 mg/kg)和咪达唑仑(5 mg/kg)混合物腹腔注射麻醉ICR雌性小鼠。麻醉完全后固定小鼠，使用直线加速器(西门子，6-MV X射线，2 Gy/min)照射小鼠骨盆，剂量为20 Gy[19]。

1.2.5总蛋白质提取 使用RIPA裂解液(Beyotime，中国上海)，将各组细胞按1.1中方法随机分组并予以相应处理，48 h后去除培养基，用PBS清洗2遍后刮下细胞，将各组小鼠膀胱组织按上1.4中方法予以相应处理。首先在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，向洗净的细胞或已制备好的组织匀浆中加入适量的蛋白裂解液，冰上静置10 min，4 ℃，12 000 r/min 20 min，得到的上清液即为细胞或组织总蛋白。取2 μL 样品加入到96孔板中，加入200 μL聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)试剂(Beyotime，中国上海)，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育30 min，在562 mm测量波长测量每组吸光度，代入标准曲线计算出蛋白浓度。

1.2.6Western blot试验 将配置好的SDS-PAGE胶固定于垂直槽电极架上，加入足量的1× Running buffer，泳道中加入各组蛋白样品，每孔上样量为含20 μg蛋白质的溶液体积，连接电泳仪，80 V稳压电泳，溴酚蓝至凝胶底边即可停止电泳，使用半干式转膜法将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h。根据蛋白marker裁剪PVDF膜，将条带加入对应的抗体稀释液中，4 ℃摇床过夜，一抗包括Nrf2、GCLC、NQO-1、HMOX-1、GPX2、α-Tubulin (Abcam Inc，Cambridge，MA，USA)。次日使用TBST清洗条带，用二抗包被PVDF膜，室温孵育1 h，脱色摇床上TBST清洗后使用化学发光凝胶成像分析仪获取化学发光图像。

1.2.7超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测 利用SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)，根据说明书步骤，处死各组小鼠后留取膀胱组织，制备5%组织匀浆，于4 ℃，3 000 r/min离心10 min后使用黄嘌呤氧化酶法(WST-1法)测定SOD活力，使用BCA试剂盒(Signalway Biotechnology LLC，美国)测量匀浆蛋白浓度。

1.2.8组织病理学分析 将小鼠膀胱组织固定于4% 多聚甲醛中，24 h后脱水并用石蜡包埋，脱蜡后再次水化，切片使用苏木素和曙红(HE)染色，干燥后使用封片液封片。

1.2.9图像定量分析 盲选法选择切片，每组小鼠膀胱至少选取10张切片，每高倍镜视野下随机选取1至2处非重叠连续黏膜，使用Image-Pro Plus 6.0 软件计算黏膜厚度和黏膜长度，进而计算平均黏膜厚度。

2 结 果

2.1T-1对X射线处理后细胞活力的影响结果如图1A所示，Control组和T-1组无明显差异，X-ray组的细胞活力下降明显。X-ray+T-1与X-ray组相比细胞活力明显升高(P<0.05)。

2.2T-1对X射线处理后细胞内活性氧的影响如图1B及1C所示，Control组和T-1组未见明显差异，X-ray组细胞内活性氧水平显著升高。X-ray+T-1与X-ray组相比细胞活性氧水平明显降低(P<0.05)。

图1丹参酮I对正常人膀胱上皮细胞的作用

A：各组细胞活力变化；B：各组细胞平均吸光度对比;C：各组细胞内活性氧水平变化。

2.3T-1对细胞Nrf2-ARE信号通路的影响如图2A及2B所示，T-I组总蛋白中Nrf2以及Nrf2信号通路中的蛋白NQO1、GPX2表达量高于对照组。X-ray+T-1组总蛋白中Nrf2、GCLC、NQO1、GPX2表达量高于X-ray组(P<0.05)。丹参酮I可以激活Nrf2-ARE信号通路，Nrf2以及下游蛋白表达量升高。

2.4T-1对X射线照射后小鼠膀胱黏膜早期损伤的影响根据黏膜厚度及黏膜层细胞结构反映膀胱黏膜损伤程度。如图3A及图3C所示，在射线照射3 d后X-ray组以及X-ray+T-1组相较Control组和T-1组黏膜厚度增加，结构紊乱。X-ray+T-1组黏膜厚度较X-ray组明显降低(P<0.05)。如图3B及图3D所示，在射线照射7 d后X-ray组以及X-ray+T-1组黏膜厚度增加，结构紊乱。X-ray+T-1组黏膜厚度较X-ray组明显降低(P<0.05)。

2.5T-1对X射线照射后小鼠膀胱组织中SOD的影响如图3E及3F所示，射线照射3 d及7 d后X-ray组SOD水平明显下降，说明射线处理后小鼠膀胱中氧化应激水平较高。而X-ray+T-1与 X-ray组组相比SOD水平有明显差异(P<0.05)。这说明了丹参酮I预处理可以降低小鼠膀胱组织氧化应激水平。

2.6T-1对小鼠膀胱组织Nrf2-ARE信号通路的影响见图4。如图4A及4B所示，射线处理3 d T-I组总蛋白中Nrf2、NQO1、GPX2、GCLC表达量高于Control组。X-ray+T-1组总蛋白中Nrf2、GCLC，NQO1，HMOX-1表达量明显高于X-射线处理组(P<0.05)。如图4C及4D所示，射线处理7 d T-I组总蛋白中Nrf2、NQO1、GPX2、GCLC、HMOX-1表达量高于Control组。X-ray+T-1组总蛋白中Nrf2、GCLC，NQO1，HMOX-1表达量明显高于X-射线处理组(P<0.05)。丹参酮I可以激活Nrf2-ARE信号通路，Nrf2以及下游蛋白表达量升高。

图2丹参酮I对细胞内Nrf2-ARE信号通路蛋白的影响

A：各组细胞总蛋白内Nrf2信号通路相关蛋白变化；

B：各组细胞蛋白表达量变化半自动化定量分析结果。

图3 丹参酮I对放射性膀胱炎早期黏膜增生及膀胱组织内SOD的影响

A、B：不同组小鼠在射线处理后3 d(A)及7 d(B)膀胱内黏膜厚度变化；C、D：不同组小鼠在射线处理后3 d(C)及7 d(D)膀胱内黏膜厚度变化半自动定量分析；E、F：不同组小鼠在射线处理后3 d(E)及7 d(F) 膀胱内SOD活性变化。

图4 丹参酮Ⅰ对小鼠膀胱Nrf2-ARE信号通路蛋白的影响

A、B：不同组小鼠在射线处理后3 d膀胱组织总蛋白内Nrf2信号通路相关蛋白变化以及半自动化定量分析；C、D：不同组小鼠在射线处理后7 d膀胱组织总蛋白内Nrf2信号通路相关蛋白变化以及半自动化定量分析。

3 讨 论

在很多研究中已经证明了抗氧化应激对放射性膀胱炎有保护作用，同时丹参酮I拥有强大的抗氧化及抗炎能力。近期研究表明丹参酮I以及丹参酮IIA以及丹参酮在肾缺血再灌注损伤、神经缺血再灌注损伤以及皮肤放射性损伤中有保护作用[17,23-24]。在我们此前的研究中也验证了丹参酮I对放射性膀胱炎的保护作用[15]。但是丹参酮I对放射性膀胱炎保护作用的分子机制尚未探索清楚。

核因子E2相关因子及抗氧化反应原件信号通路Nrf2-ARE是近年来氧化应激损伤与治疗研究领域的热点。Nrf2有一高度保守的碱性亮氨酸拉链(b Zip)结构。正常情况下，Nrf2 和细胞骨架相关蛋白 Keap1以N端的Neh2区域结合成二聚体的形式存在于细胞浆中，从而使保护细胞的酶类和抗氧化物处于基础表达水平，细胞处于稳定状态。当细胞处于氧化应激损伤时，Nrf2与Keap1发生解离。Nrf2和Keap1解离后，Nrf2转位进入细胞核并与ARE启动子部位结合，启动谷氨酰半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCLC)、醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase，NQO1)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX-1)、谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)等抗氧化基因的表达，达到防御氧化应激损伤的目的。我们的研究表明 Nrf2-ARE 信号通路是在放射性膀胱损伤中起到重要作用。

本实验通过体外和体内两部分证明T-1对放射性膀胱炎有保护作用，Nrf2-ARE 信号通路的激活在其中可能产生重要作用。在体外实验中，我们发现X-ray+T-1组比X-ray组中细胞产生的 ROS 明显减少，并且细胞活力明显升高。因此我们确定T-1可以作用于人膀胱上皮细胞。T-1处理组总蛋白中Nrf2有不同程度的升高，同时Nrf2-ARE信号通路中的多种抗氧化酶(如GCLC、NQO1、HMOX1、GPX2)表达量随之一同升高。因此证明丹参酮I可以激活Nrf2-ARE信号通路，可能在正常膀胱上皮细胞对抗X射线损伤中起重要作用。体内实验中我们发现在T-1可以缓解器官内的氧化应激状态和急性期膀胱黏膜损伤。由于本课题组长期从事放射性损伤的基础研究，放射性膀胱炎模型的建立较为成熟，在前期工作中80%以上的小鼠在接受20 Gy的盆腔局部照射后膀胱会出现放射性膀胱损伤典型的组织形态学改变，因此本实验选取20 Gy射线剂量进行造模[15,19,25]。射线处理3 d以及7 d后，将T-1处理组与Control组以及X-ray+T-1组与X-ray组进行对比，我们发现T-1组和X-ray+T-1总蛋白中Nrf2以及信号通路中的多种抗氧化酶有不同程度的升高，结果表明丹参酮I可以激活Nrf2-ARE信号通路，可能在缓解小鼠膀胱组织X射线急性损伤中起重要作用。在丹参酮缓解紫外线引起的皮肤损伤以及砷引起的肺损伤的相关研究中，有研究者提出丹参酮I可能通过激活Nrf2信号通路阻抑组织损伤形成的假设，他们最终的研究结果与我们的结果相似[16-17]。但是本次实验仍有以下两点不足：首先抗氧化应激作用的信号通路不仅仅只有一个，不能排除T-1同时通过其他信号通路对放射性膀胱炎起到保护作用；其次我们的实验尚不能完全证明T-1直接激活Nrf2，需要构建Nrf2沉默及过表达的稳转质粒从而在细胞模型中进一步验证T-1对Nrf2-ARE信号通路的影响，同时需进一步探索T-1在Nrf2缺陷小鼠中能否起保护作用。

总而言之，我们通过实验验证了丹参酮I通过激活Nrf2-ARE信号通路在放射性膀胱炎早期产生保护作用，为进一步阐明丹参酮I治疗放射性膀胱炎的可能机制提供了理论依据。我们仍需进一步研究丹参酮I的作用机制，以推动其在放射性膀胱炎中的临床应用，拓展祖国传统医学在临床难治性疾病中的应用。