小鼠TSC21基因敲除打靶载体的构建和胚胎干细胞同源重组克隆的鉴定

殷正伟，王朝亮，张天标，杨 超，张卫星

郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州 450052

男性不育已成为世界范围的生殖难题[1]。不育症的发生与睾丸特异性基因密切相关[2-4]。TSC21[5]是郑州大学泌尿外科重点实验室首次鉴定出的一个睾丸特异性表达新基因，前期研究[5]证实TSC21基因在人和小鼠体内均呈现睾丸特异性和年龄依赖性表达模式，免疫组化结果证实，TSC21蛋白主要在人精母细胞和圆形精子细胞中表达，且在隐睾症患者和无精子症患者睾丸组织中的表达水平明显下降。为从整体水平探讨TSC21基因在男性精子发生及男性不育症中的作用和相关机制，郑州大学泌尿外科重点实验室构建了小鼠TSC21基因敲除打靶载体，为进一步建立TSC21基因敲除小鼠模型奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 质粒和菌株 129细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)质粒(编号：bMQ-158P8)订购于基因服务公司；PL253、PL452质粒由美国国立癌症研究所惠赠；DH5α、EL350大肠杆菌由郑州大学泌尿外科重点实验室保存。

1.1.2 129小鼠胚胎干细胞(ES细胞) 129品系小鼠ES细胞由郑州大学泌尿外科重点实验室保存。

1.1.3 PCR引物和Southern blot探针引物 根据129 BAC质粒序列分析结果，结合小鼠TSC21基因序列 (GenBank登录号：AK005862)，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计6对引物。引物由南京金丝瑞生物科技有限公司合成。MⅠ-f，5’-ATTTGCGGCCGCGCCACAGTGTCTCACATAGA-3’；MⅠ-r，5’-CCCAAGCTTTGAGCAACACACCCTAGATA-3’；用来扩增Retrieving-5’同源臂，并分别引入酶切位点NotⅠ和HindⅢ。MⅡ-f，5’-CCAAGCTTAGATA TTGTAAATATTTCCTTTC-3’；MⅡ-r，5’-GGATCCGC GGGTACTTTAGGAAGATAAAC-3’；用来扩增Ret rieving-3’同源臂，并分别引入酶切位点HindⅢ和BamHⅠ。Loxpl-f，5’-ACGGGTCGACTTAGCATTC AGGAGG-3’；Loxpl-r，5’-CCGGAATTCGGTTTAGAA CAGGAT-3’；用来扩增Retrieving-5’同源臂，并分别引入酶切位点SalⅠ和EcoRⅠ。Loxpr-f，5’-CGCG GATCCTATAGAATGTATGTAG-3’；Loxpr-r，5’-ATAA GAATGCGGCCGCGTGAAATCCACTTCTAGTC-3’；用来扩增Retrieving-3’同源臂，并分别引入酶切位点BamHⅠ和NotⅠ。BamHⅠ-f，5’-TATGTTGAAG CATACTAGAGATGG-3’；BamHⅠ-r，5’-TACACGTTC AGAGACAACCT-3’；用来扩增5’端Southern blot 探针。SacⅠ-f，5’-CTTTAAGTGAGAGAGAATCTG-3’；SacⅠ-r，5’-TTAGACTCACACCTAACCTAA-3’；用来扩增3’端Southern blot探针。

1.1.4 工具酶、试剂盒及其他试剂 限制性核酸内切酶(NotⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ、SacⅠ、EcoRⅠ等)、高保真扩增PCR用DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、碱性磷酸酶购自TaKaRa公司；氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司。拜厄斯宾PCR产物纯化试剂盒、拜厄斯宾切胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物购自英国奥克西德公司。质粒中抽试剂盒购自Promega 公司。达尔伯克改良培养基、胎牛血清购自Gibco 公司。丝裂霉素C、遗传霉素、更昔洛韦购自Sigma公司。磷酸盐缓冲溶液、Southern blot转膜液、预杂交液、杂交液、洗膜液由郑州大学泌尿外科重点实验室配制。Zeta探针印迹膜购自Bio-Rad公司。同位素α-P32-三磷酸脱氧胞苷购自 PerkinElmer公司。测序由南京金丝瑞生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1 基因敲除策略 小鼠TSC21基因定位于染色体6C3位点，包含4个外显子，其cDNA长810 bp，开放阅读框543 bp，编码含180个氨基酸、相对分子质量为21 040的蛋白质。由于起始密码子ATG位于外显子2，所以决定敲除外显子2～外显子4。

1.2.2 PL253 retrieve小载体的构建 提取129 BAC质粒DNA，分别用2对引物MⅠ-f、MⅠ-r 和MⅡ-f、MⅡ-r PCR扩增Retrieving-5’及 Retrieving-3’ 同源臂。反应体系如下：NDA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL、dNTP 混合物(2.5 mol/L)4 μL、上游引物 (10 μmol/L) 1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、5×Prime STAR缓冲液(含Mg2+)10 μL、BAC DNA 1 μL、MilliQ水32.5 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。上述PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定切胶回收后，用限制性核酸内切酶(NotⅠ+HindⅢ)酶切Retrieving-5’同源臂，用限制性核酸内切酶(HindⅢ+BamHⅠ)酶切Retrieving-3’同源臂。同时用限制性核酸内切酶(NotⅠ+BamHⅠ)酶切PL253质粒DNA并回收PL253大片段。将上述酶切回收后的Retrieving-5’、Retrieving-3’同源臂和PL253大片段用T4连接酶连接构建含左右Retrieve同源臂的PL253质粒。此连接产物经HindⅢ线性化后电转到含129 BAC质粒的EL350菌中，在Retrieving-5’及Retrieving-3’同源臂的介导下129 BAC质粒将会和PL253连接产物发生同源重组。

1.2.3 PL452小载体的构建 以129 BAC质粒DNA为模板，分别用2对引物Loxpl-f、Loxpl-r和Loxpr-f、Loxpr-r PCR扩增Retrieving-5’及Retrieving-3’同源臂。反应体系同1.2.2。 PCR程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PL452质粒DNA 和Retrieving-5’同源臂切胶回收产物经SalⅠ+EcoRⅠ酶切后用T4连接酶连接，将连接产物转化到DH5α感受态细胞、培养、提取质粒DNA后用SalⅠ+EcoRⅠ酶切鉴定连接产物。以同样的方法将Retrieving-3’同源臂连入已经连接Retrieving-5’同源臂的PL452质粒，用NotⅠ+BamHⅠ酶切鉴定连接产物。

1.2.4 TSC21打靶载体的构建 PL452小载体经NotⅠ+SalⅠ+ScaⅠ线性化后，电转到含PL253小载体的EL350菌里，在Retrieving-5’及Retrieving-3’ 同源臂的介导下PL253小载体将会和PL452小载体发生同源重组，将电转后的菌液接种到氨苄青霉素+卡那霉素LB平板、培养、提取质粒DNA后用EcoRⅠ酶切鉴定发生了同源重组的EL350菌克隆，选择性扩增经EcoRⅠ酶切鉴定同源重组阳性的EL350菌克隆，提取质粒DNA后再次用BglⅡ、KpnⅠ和SacⅡ酶切鉴定。

1.2.5 ES细胞电转染 取129小鼠ES细胞，传代后用体积分数10%胎牛血清-DMEM和0.01 μg/L丝裂霉素C 37 ℃处理2～3 h。计数稀释后铺到用体积分数0.1% gelatin 预处理的10 cm培养皿上，制成饲养层细胞。扩增后的129 ES细胞经Trypsin/EDTA消化处理后用磷酸盐缓冲溶液重悬至细胞密度为1×107mL-1的单细胞状态。取0.8 mL的细胞悬液，加入25 μg线性化的PL253打靶载体质粒DNA，240 V 500 μF电转，电转后的ES细胞转到含有饲养层细胞的培养皿中，24 h后换成ES细胞筛选培养液(含遗传霉素200 mg/L、更昔洛韦2.5 μmol/L)。电转染8～10 d后挑ES细胞克隆于96孔板中，扩增后1 ∶3传代，其中1板用于提取基因组DNA，另外2板冻存。

1.2.6 ES细胞基因组PCR鉴定及Southern blot鉴定 将上述遗传霉素/更昔洛韦抗性的ES细胞克隆扩增后提取基因组DNA，然后用PCR方法扩增5’端同源臂(TSC21-ES-f，5’-GATCATGTTTTCAGTATGTTGAAGCA-3’；TSC21-ES-r，5’-AAGGGTTATTGAATATGATCGGA-3’)，初步筛选发生了同源重组的ES细胞。在此基础上，选择性扩增经PCR鉴定同源重组阳性的ES细胞克隆，提取基因组DNA后，BamHⅠ酶切消化用于Southern blot 5’端鉴定，SacⅠ酶切消化用于Southern blot 3’端鉴定。5’端杂交探针为扩增的541 bp片段，3’端杂交探针为扩增的700 bp片段。酶切反应体系：80 μL ES细胞基因组DNA，10 μL缓冲液，10 μLBamHⅠ(SacⅠ)，37 ℃水浴8 h。10 g/L琼脂糖凝胶电泳，40 V 8 h，用虹吸转移法将DNA转移到Zeta-probe blot膜上。65 ℃预杂交3 h，杂交12 h，洗膜3次，每次15 min，最后-80 ℃ X光片曝光72 h，洗片。

2 结果

2.1PL253retrieve小载体的构建引物MⅠ-f、MⅠ-r 和MⅡ-f、MⅡ-r PCR均扩增出特异Retrieving同源臂，大小与预期一致，均为600 bp，且测序结果与预期一致。Retrieving同源臂和PL253质粒大片段的连接产物电转到含129 BAC质粒的EL350菌后，涂板、提取质粒DNA，酶切结果表明129 BAC质粒与PL253同源臂载体发生了正确的同源重组，酶切后产生3条条带，分别为7 214、6 676、4 223 bp，与预期结果吻合(7 214和 6 676 bp条带相距太近，琼脂糖凝胶电泳难以区分)。见图1。

M：DNA Marker；1～6：重组后PL253 retrieve小载体

2.2PL452小载体的构建引物Loxpl-f、Loxpl-r和Loxpr-f、Loxpr-r PCR均扩增出特异Retrieving同源臂，大小与预期一致，分别为538和563 bp，且测序结果与预期一致。PL452质粒连接Retrieving-5’和Retrieving-3’同源臂之后其连接产物转化到DH5α感受态细胞，培养、提取质粒DNA后酶切结果表明PL452小载体构建成功，酶切后产生2条条带，分别为4 986和563 bp，与预期结果吻合。见图2。

M：DNA Marker；1、2、4、5：构建失败的PL452小载体；3：构建成功的PL452小载体

图2PL452小载体酶切鉴定结果

2.3TSC21打靶载体的构建PL452小载体电转到含PL253小载体的EL350菌里后，取电转后的菌液涂板、培养、提取质粒DNA，酶切结果表明有2个同源重组阳性克隆存在。选择性扩增培养这2个克隆，提取质粒DNA后，再次进行酶切鉴定，结果显示酶切条带大小与预期一致，TSC21打靶载体构建成功。见图3。

1、2：BglⅡ酶切产物(9 669、4 082、1 457 bp)；3、4：KonⅠ酶切产物(7 214、4 223、3 717 bp)，4 223和 3 717 bp条带相距太近，琼脂糖凝胶电泳难以区分；5、6：SacⅠ酶切产物(7 801、4 130、3 223 bp);M:DNA Marker

图3TSC21打靶载体酶切鉴定结果

2.4ES细胞基因组PCR鉴定及Southernblot鉴定挑取经遗传霉素/更昔洛韦正负筛选的ES细胞克隆96个于96孔板中，扩增培养后提取基因组DNA，PCR扩增5’端同源臂初步筛选得到5个同源重组阳性ES细胞克隆。扩增培养这5个ES细胞克隆，提取基因组DNA，分别进行5’端 和3’端Southern blot鉴定。在5’端的鉴定中，1H、4G、5C、5H 4个克隆在27 800和8 000 bp位置均有1个条带，129阴性对照仅在27 800 bp处有1个条带；在3’端的鉴定中， 1H、5C 2个克隆在12 000和7 200 bp位置均有1个条带，129阴性对照仅在12 000 bp处有1个条带。可知1H、5C 2个ES细胞克隆就是所需要的同源重组阳性ES细胞克隆。见图4、5。

5H、1H、4G、3D、5C：分别为扩增同源臂筛选得到的5个同源重组阳性ES细胞克隆DNA；M：DNA Marker

图4 5’同源臂PCR初步筛选ES细胞同源重组阳性克隆

129：阴性对照；5H、1H、4G、3D、5C：分别为扩增同源臂筛选得到的5个同源重组阳性ES细胞克隆DNA；M：DNA Marker

图5ES细胞基因组DNASouthernblot鉴定结果

3 讨论

基因敲除技术是目前从整体水平研究特定基因功能的主流技术。近年来发展起来的大肠杆菌同源重组系统和129品系BAC文库末端测序的完成使得基因敲除技术突破了传统上打靶载体构建时受基因组DNA上限制性内切酶位点强烈局限的限制，使打靶载体的构建变得高效、省时、灵活。

郑州大学泌尿外科重点实验室在构建TSC21打靶载体的过程中兼顾了以下几个方面的问题：①同源臂长度的选择。前人的研究[6]表明打靶载体同源臂的长度对打靶效率的影响很大，一般认为同源重组效率与同源臂的长度呈正比[7-8]，PCR扩增长片段序列容易引入突变，本次打靶载体构建在大肠杆菌同源重组系统内进行，最终打靶载体5’端同源臂长5 000 bp, 3’端同源臂长3 000 bp，从而保证同源重组的效率。②同源臂序列正确性的保证。经PCR方法得到2对同源臂之后，进行了酶切验证和测序，确保同源臂序列准确无误，保证同源重组的效率。③TSC21打靶载体正确性的验证。TSC21打靶载体构建出来后首先用EcoRⅠ酶切，初步筛选到2个同源重组阳性克隆，选择性扩增培养这2个克隆，提取质粒DNA后，再次用多种内切酶进行验证，确保所筛选到的同源重组阳性克隆准确无误。④129 BAC质粒与ES细胞的同源性。2对同源臂都是以129 BAC质粒为模板用PCR方法扩增得到的，后期电转所用的ES细胞也来自于129小鼠品系，因此同源臂与靶基因同源，可以提高同源重组发生的频率。

TSC21在隐睾症患者和无精子症患者睾丸组织中的表达水平明显下降，作者推测TSC21与哺乳动物精子发生过程密切相关。精子发生是大量睾丸特异性基因、睾丸高表达基因按时空顺序表达与睾丸组织内外环境共同作用的结果，例如Fank1[9]、Ccdc136[10]、Zmym3[11]、Zfp318[12]、Cdh2[13]等皆被证明为睾丸特异性基因并在精子发生过程中起重要作用。这些基因参与了小鼠精子发生过程中的染色质包装、染色质调控[14]、精子尾巴形成、能量代谢、顶体形成、透明带结合和信号传导[15]等。分析这些基因的组织表达特点、探讨其特殊功能，将有助于明确这些基因在精子发生过程中的作用，为生精障碍患者寻找新的生物治疗靶点。郑州大学泌尿外科重点实验室有鉴于此构建了TSC21基因敲除打靶载体，为TSC21基因敲除小鼠模型的建立及进一步的研究奠定了基础。