荜茇药材中荜茇酰胺高效液相色谱研究※

贾贵清 吴小愚 王玉珏 赵高平*

（1 四川省医学科学院·四川省人民医院胃肠外科，成都 610072；2 四川科伦药业股份有限公司，成都 610072）

荜茇（Piper Longun L.），系胡椒科（Piperaceae）植物，其常用入药部位是干燥近成熟或成熟的果穗，味辛大温，无毒，归胃、大肠经，具有温中散寒、下气止痛之功效，中医多用于治疗泄泻、偏头痛及牙痛等，是中、蒙、藏、维医的习惯用药，收载于《中国药典》 (2015年版一部)[1]及《中华人民共和国药典卫生部药品标准维吾尔药分册》[2]。现代研究表明荜茇具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏、抗炎、止痛及免疫调节、降血脂、镇静、抗惊厥、抗胃溃疡、耐缺氧、抗急性心肌缺血、抗心律失常等多种药理学活性[3-4]，其中荜茇酰胺是其主要药理成分，对肿瘤细胞具有显著细胞毒作用，还具有抗血小板、抗动脉粥样硬化、抗狼疮性肾炎、抗帕金森病等作用，表现出抗血小板凝集、抗炎镇痛、抗真菌等诸多药理活性[5]，越来越受到人们的关注。

由于中药不良反应事件不断被报道，所以中药安全性已为国内外所关注，对于中药的质量控制要求更为严格[6]。2015版《中国药典》收载胡椒碱作为荜茇果实药材的指标性成分，但荜茇中的成分较为复杂，为了更准确地控制荜茇药材的含量，本文旨在以荜菝酰胺为指标性成分，以成熟稳定的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 为手段，建立分析方法，用于对不同产地荜茇药材及其不同药用部位进行对比分析，为荜茇药材的道地性和质量评价提供更全面可靠的依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪系列，包括：检测器 (G1365D DAD)，四元梯度泵 (G1311A Quat Pump)，在线真空脱气机 (G1332A)，自动进样器 (G1329A ALS)，柱温箱 (G1316A Colcom)， 工作站 (Agilent Chemstation system) (Agilent Technologies， 美国)；超声波清洗器，甲醇（HPLC级）、超纯水、荜茇酰胺对照品（上海源叶生物科技有限公司），其余试剂均为分析纯。荜茇药材分别来自于广西、广东、海南、福建、江西，经四川大学华西药学院何俊博士鉴定为胡椒科植物荜茇Piper longum L.

2 研究方法

2.1 色谱条件 Agilent 1100， 色谱柱为迪马Diamond C18， 5μm 250×4.6mm， 流动相甲醇-水 （35∶65）， 流速1 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取荜茇酰胺对照品10.35 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为胡椒碱储备液，依次精密吸取1、2、4、6、8、9 mL分别容于10 mL容量瓶中，加甲醇定容后，即得系列荜茇酰胺对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的荜茇药材粉末0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇30 mL，浸泡60 min后，超声提取40 min（150 w/60 KHz），过滤，重复2次，合并滤液，减压蒸馏挥干溶剂，残渣用甲醇溶解定容至25 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下制备的标准溶液20 μL按“2.1”项下中的色谱条件进样测定。以标准溶液浓度为横坐标 (X)，峰面积为纵坐标 (Y)进行线性回归，得回归方程，记录峰面积值。

2.3.2 精密度试验 精密吸取同一浓度的荜茇酰胺对照品标准溶液20 μL，在2.1项下色谱条件，连续进样6次，计算峰面积的相对标准偏差RSD值。

2.3.3 重复性试验 取同一批次的药材粉末，按照“2.3.2”项下的方法制备样品溶液6份，按照“2.1”项下的色谱条件测定，计算峰面积的RSD值。

2.3.4 稳定性试验 取同一浓度的荜茇供试品溶液分别在0、1、2、4、8、12、16、24 h进样测试，计算峰面积的相对标准偏差RSD，了解24 h内试剂稳定性。

2.3.5 加样回收试验 分别精密称取已知荜茇酰胺含量的荜茇药材粉末6份，每份约0.5g。精密称取荜茇酰胺对照品20.08 mg，甲醇溶解定容至50 mL，分别精密量取5 mL加入上述粉末中，按照“3”项下的方法制备样品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。

2.4 荜茇药材的含量测定 取不同产地及不同药用部位的荜茇药材粉末按照“3”项下方法制备样品溶液，每批6个平行样品，精密吸取20 μL按上述色谱条件进样测定，并计算含量和RSD值。

3 结果

线性关系考察进样测定得到回归方程为A=13587685.5C-48597.12（r=0.9999）， 在 0.0411～0.3835 mg·mL-1浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系，色谱图见图1。精密度试验结果显示RSD=1.89%（n=6），提示精密度良好。重复性试验结果表明该法重复性良好，RSD=2.66%。该方法在24 h内稳定性良好，其RSD=2.73%（n=8）。而试验加样回收率在98.40%～102.38%，表明试验方法具有较好的准确度，见表1。不同产地的荜茇药材果实及茎中荜茇酰胺的含量有一定的差异，其中以广西田林县荜茇果实中荜茇酰胺含量最高，见表2。浦北县荜茇茎中荜茇酰胺含量最高，见表3。

图1 对照品（A）和供试品（B）液相色谱图

表1 加样回收试验

表2 不同产地的荜茇果实中的荜茇酰胺含量 （n=6）

表3 不同产地的荜茇茎的荜茇酰胺含量 （n=6）

图2 荜茇酰胺

4 讨论

荜茇酰胺又称荜茇明碱，其化学名为3、4、5-三甲氧基肉桂酰环己酰胺，分子式为C17H19NO5，结构如图2。属于生物碱酰胺类化合物，最初主要从印度南部以东南亚的胡椒科植物荜茇的根中分离而得，在长柄胡椒 (P.sylvaticumRoxb.)和瘤突胡椒（P.tuberculatum Jacq.）的根中可以分离得到。近年来，大量研究发现荜茇药材中主要的药理作用为荜茇酰胺，后者具有抗炎、镇痛、抗抑郁，甚至抗恶性肿瘤等多种药理活性作用，且对正常的细胞、组织、器官无明显的毒副作用[4-5，7-8]。2011年Raj等[9]在《Nature》上发表了荜茇酰胺体外试验具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，而对正常组织细胞无明显影响，并且详细得出了植物天然成分荜茇酰胺不依赖p53等抑癌基因的状态，能明显降低乳腺癌细胞株、骨肉瘤癌细胞、慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤B细胞等14种不同起源的肿瘤细胞株的活力，其平均半数致死量（IC50）为7 μmol/L，而即使将荜茇酰胺浓度增加到15 μmol/L也不影响主动脉内皮细胞、乳腺上皮细胞、皮肤成纤维细胞等6种非肿瘤细胞株的活力。同时，研究发现低摩尔浓度的荜茇酰胺也能抑制EBV非转染及转染B淋巴肿瘤细胞的生存平衡，且不伤害正常外周血B淋巴细胞没有毒性。荜茇酰胺还可以降低核转录因子-κB的活性，下调c-myc的表达，通过影响NF-κB/MYC关键靶基因 (如下调MYB、E2F1和上调GADD45B)的表达水平，进而杀伤淋巴肿瘤细胞。此研究也为B细胞恶性肿瘤的治疗策略以及其他类型血液癌症的预防和治疗提供新方法[10]。因此，Raj等人的研究再次掀起了对中国传统药材荜茇抗肿瘤的研究热潮，而目前对荜茇酰胺的提纯与净化等工序尚无完整、统一的标准。

中药材成分复杂，一般以其具有生理活性的主要化学成分作为质量评价和质量控制指标，目前在中药的质量控制方面，倾向于多成分、多指标控制。而以往对于荜茇的质量控制只采用胡椒碱为单一指标成分。本实验突破了以往仅采用胡椒碱为指标成分的指标质量控制方法，还研究测定荜茇中荜茇明酰胺的含量，为荜茇药材多指标质量控制标准的建立提供了依据，也为含此类酰胺类生物碱类成分的其他药材定量分析提供了参考。常用的测定方法有紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法、气相色谱法、核磁共振波普法等[11]，其中HPLC分为分析型和制备型高效液相色谱法两种，适用于极性、非极性、离子型及高分子化合物的分离与分析，是以经典的液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论和试验方法，高压输送流动相，采用高效固定相及在线检测等手段发展而来，具有分离效能高、分析速度快及应用范围广等优点。本研究采用分析型高效液相色谱法，通过对不同检测波长（200～400 nm）扫描检测和图谱分析比较，在250 nm时能检测到较多的荜茇酰胺成分峰信息，故选择250 nm作为检测波长。查阅有关文献[1]，对甲醇-水，甲醇-0.2%甲酸，乙腈-水，乙腈-0.2%甲酸不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱试验摸索和比较分析，结果表明，甲醇-水（35∶65） 进行梯度洗脱得到的图谱色谱峰分离度好，基线平稳，保留时间适中，最终确定以甲醇-水一定比例洗脱作为流动相，以254 nm为检测波长的基本色谱条件，这与徐丽芳[12]应用HPLC测定山香圆叶药材的方法相似，但采用乙腈-0.5%磷酸水溶液、波长在200～400 nm，未进行波长分析比较。制备型高效液相色谱法的理论与设备基础目前尚未完善，但是是以分析型为基础，随着中药学科的不断发展，中药含量测定的研究也会更加的全面，制备型的高效液相色谱法会表现出更为广阔的前景。

荜茇生长在海拔200～1000 m的低谷、河谷和盆地边缘的湿热地区，我国国内主产于云南、广东，北方如河北等地也有生长，国外主产于印度尼西亚、菲律宾、越南等国，不同产地及不同药用部位的中药材存在一定的成分差异[13-14]，本研究证实我国广西田林县荜茇果实中荜茇酰胺含量最高，而安徽亳州市的荜茇中荜茇酰胺含量最低，中药材中各成分含量的高低可能与药材生长的海拔、纬度、土壤以及日照强度和时间等因素有关。此外，同一株中药材植物不同药用部分中成分含量也不尽相同，荜茇酰胺在果实中含量最高，茎、叶中含量较少，我们的研究也证实了果实中荜茇酰胺的含量较茎中高。

综上所述，本研究证实了不同产地及不同药用部位荜茇中荜茇酰胺的含量有所差异，同时建立了一种HPLC测定荜茇药材中荜茇酰胺含量的方法，结果显示该方法精密度高、稳定性及重复性和加样回收率等较为理想，提供了一种快速、准确、经济的测定荜茇中荜茇酰胺含量的方法，值得推广。