参葵汤对卵巢癌模型大鼠淋巴细胞、免疫球蛋白及相关炎症因子的影响*

霍 亮,葛倩倩

1.河南省信阳市中心医院肿瘤外科一病区(信阳 464000),2.郑州大学第五附属医院妇产科 (郑州450007)

主题词 卵巢囊肿/中医药疗法 @参葵汤 动物实验 大鼠 T-淋巴细胞亚群

卵巢癌发病率占妇科肿瘤第三位，但其病死率居妇科肿瘤之首，严重威胁着女性健康。近年来，随着人们对免疫原性的理解逐渐深入，卵巢癌的免疫疗法引起了研究人员的重视，提高机体的免疫功能成为了一种新的抗肿瘤思路[1-2]。参葵汤作为一种扶正祛邪方药，能够增强机体免疫力，抑制肿瘤细胞的增殖。本实验通过研究参葵汤对卵巢癌模型大鼠淋巴细胞、免疫球蛋白及相关炎症因子的影响，探讨传统中药治疗卵巢癌的作用机制，为临床提供一定的理论依据。

材料与方法

1 动物及试剂 雌性Wistar大鼠90只，体质量110～140 g，鼠龄8周，购自中国科学院动物中心；低分化卵巢癌NUTU-19细胞株购自Sigma公司；试剂盒购自北京博奥生物有限公司。

2 方剂组成 参葵汤组成：龙葵、黄芪各30 g，苦参、墓头回、山慈菇、女贞子各20 g，当归12 g，莪术、甘草各6 g。每剂327 g，煎至200 ml。

3 实验方法

3.1 动物模型建立及分组:取卵巢癌NUTU-19细胞株培养至2×107个/ml，接种于雌性Wistar大鼠右侧腋窝皮下，饲养10 d后，若接种位置出现约4 mm×4 mm的肿瘤则认为造模成功[3]。将90只造模成功的大鼠随机分为模型组、顺铂组和中药组，每组各30只。

3.2 给药方法: 中药组每日空腹时灌注所煎中药2 ml，2 d/次，连续灌服5次；顺铂组每日腹腔注射注射用顺铂(国药准字H37021358)2 mg/kg，2 d/次，连续注射5次；模型组腹腔灌注与顺铂等体积的生理盐水，2 d/次,连续注射5次。给药结束后，取大鼠的血清进行检测。

3.3 样本测定方法:血清炎性因子IL-2、TNF-α测定方法为，抽取大鼠腹主动脉血液装在不含抗凝剂的采血管中，室温下放置20～30 min，自然凝集后离心分离血清，利用酶联免疫吸附法测定IL-6、TNF-α含量。

T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+)百分率：对外周血进行淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离，对有核细胞染色标记30 min，吸走上清液，清洗两次后检测CD4+、CD8+水平。

血清中IgG、IgM测定：采用单项辐射状免疫扩散法对血清中IgG、IgM进行测定。

4 统计学方法 本研究所得数据采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，均数±标准差的形式表示计量资料，组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验分析数据资料，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠血清炎性因子和免疫球蛋白比较 见表1。经过为期10 d的喂养，与模型组比较发现顺铂组和中药组血清炎性因子IL-6、TNF-α水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；顺铂组与中药组相比，血清炎性因子IL-6、TNF-α无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较发现顺铂组和中药组免疫球蛋白IgG、IgM水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；顺铂组与中药组相比，免疫球蛋白IgG、IgM水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2 各组大鼠T淋巴细胞亚群指标比较 见表2。与模型组比较发现顺铂组和中药组CD4+百分率明显增高，两组较模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，顺铂组与中药组相比CD4+百分率无统计学意义(P>0.05)；顺铂组和中药组CD8+百分率较模型组降低明显，两组较模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，中药组与顺铂组相比CD8+百分率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；顺铂组和中药组CD4+/CD8+较模型组明显增高，两组较模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，顺铂组较中药组相比CD4+/CD8+明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠血清炎性因子和免疫球蛋白比较

注：t1、P1代表顺铂组与模型组比较；t2、P2代表中药组与模型组比较；t3、P3代表中药组与顺铂组比较

表2 各组大鼠T淋巴细胞亚群指标比较

注：t1、P1代表顺铂组与模型组比较；t2、P2代表中药组与模型组比较；t3、P3代表中药组与顺铂组比较

讨 论

卵巢癌作为妇科肿瘤中死亡率最高的肿瘤，近年来发病率越来越高，严重威胁着女性健康[4-6]。2018年发布的卵巢癌的大数据研究表明，自2003年至2010年间我国卵巢癌发病率呈上升趋势，新发病例和死亡病例也居高不下。单2015年我国就有52100名女性被确诊为卵巢癌，约22500例患者死于卵巢癌[7-9]。卵巢癌发病初期并无明显症状，约70%的患者确诊时已是中晚期，丧失了手术机会，并且单纯的化疗控制卵巢癌复发率高，不良反应多，因此，迫切的需要寻求一种能够有效抑制肿瘤生长，减少不良反应，提高患者生活质量的新型药物。中医学中卵巢癌属于“石瘕”、“癥瘕”之症，参葵汤作为扶正祛邪方药，对于治疗气虚血瘀型卵巢癌有确切的疗效[10]。其成分主要有以苦参、龙葵为君药，有清热解毒，利湿消肿之功效；山慈菇、墓头回、莪术为臣药，有破血散结，助主药攻毒之功效；黄芪、女贞子、当归等为佐药，有益气养血之功效；甘草为使药。苦参中含有苦参碱，有抗癌活性[11]，苦参碱能够有效降低小鼠腹腔巨噬细胞抑制P815肿瘤细胞增殖效应；龙葵中的龙葵碱有抗肿瘤细胞核分裂的作用，大量研究标明龙葵碱能够表现出明确的细胞毒性作用。

本研究主要目的是为了研究参葵汤对卵巢癌大鼠模型的干预机制，并同传统化疗药物顺铂作比较，使实验更有说服力。血清炎性因子IL-6主要由Th2细胞分泌，它能够促使机体B细胞前体产生抗体细胞，使得自然杀伤细胞的裂解功能增强，通过检测IL-6能够预测机体的免疫状态。大量的研究发现，TNF-α在肿瘤患者体内是过量合成和分泌的，并且肿瘤患者自身的免疫功能受其抑制。本实验研究发现，给予卵巢癌模型大鼠腹腔注射参葵汤和顺铂均能够使得IL-6、TNF-α水平显著降低。免疫球蛋白IgG、IgM作为机体最重要的免疫分子是机体对抗外来入侵的主要物质，其浓度的高低能间接的反映机体免疫应答的强弱。本研究表明，中药组和顺铂组IgG、IgM浓度均较模型组降低，并且给予参葵汤的模型大鼠IgG、IgM浓度与给予顺铂的模型大鼠相比也有明显的降低，表明参葵汤能够有效的提高机体的免疫功能。CD4+为辅助T细胞主要表面标志，CD8+是细胞毒性T淋巴细胞的主要表面标记物质。人机体内通过不同的T淋巴细胞相互作用，以维持机体正常免疫功能。但随着机体发生病理变化，CD4+和CD8+及其比值均会发生相应的变化。本实验中，模型大鼠由于接种了卵巢癌细胞，其免疫功能发生紊乱，给予参葵汤和顺铂腹腔灌注后使得CD4+百分率明显升高，CD8+百分率明显降低，CD4+/CD8+明显升高，同时中药组较顺铂组CD4+百分率明显升高，CD8+百分率明显降低，CD4+/CD8+明显升高，表明参葵汤能够明显改善机体免疫功能降低，提高模型大鼠免疫功能的作用。