安胃汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠细胞凋亡因子表达的影响*

李铁军,魏书堂,李 惠,张 威,王慧超

河南大学第一附属医院(开封 475001)

主题词 胃炎, 萎缩性/中医药疗法 @安胃汤 动物实验 大鼠

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是我国常见的消化系统疾病之一，主要表现为腹痛腹胀、恶心呕吐、嗳气、食欲减退等，严重者甚至出现贫血[1]。近年来，随着生活方式的改变，慢性萎缩性胃炎的发病率呈明显增高趋势，目前已被认为是一种癌前病变，其癌变的进程是慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-不典型增生-胃癌[2]，该进程是难以逆转的，但是如何阻断疾病的发展是研究的热点。已有大量研究显示，胃黏膜细胞增殖与凋亡功能的紊乱是CAG主要病理环节，其中最关键的因素是细胞的异常凋亡，与细胞凋亡有关的因子可分为促细胞凋亡因子和抑凋亡因子[3]。西医以抑制胃酸和抗幽门螺杆菌治疗为主，主要是缓解患者症状，对阻断疾病进展作用不明显。中医药治疗CAG有独特优势，一方面能够改善病情，另一方面从整体出发，调节机体修复能力，而且治疗费用低，易推广[4]。本次研究，笔者通过对CAG模型大鼠采用安胃汤治疗，观察其对相关细胞凋亡因子的影响，探讨药物的作用机制，现将结果做如下报道。

材料与方法

1 动 物 健康清洁级wistar大鼠62只，雄性，体重151～200 g，购于广西医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(湘)2014-0005。分笼饲养：温度(24±2) ℃，湿度70%±10%，自由饮食水。

2 主要药物与试剂 安胃汤免煎颗粒(由黄连5 g，丹参、百合各15 g，白芍20 g，法半夏、乌药各10 g，干姜、炙甘草各6 g组成)：我院药剂科提供。胃复春片产自杭州胡庆余堂药业有限公司，规格0.36 g/片，国药准字号2017021510。甲基硝基亚硝基胍(MNNG)购于日本东京化成株式会社;10%水合氯醛购于青岛宇龙海藻有限公司;无水乙醇购于济宁铭达新材料有限公司;苏木精伊红染色试剂盒、RIPA 组织裂解液购于武汉博士德生物有限公司;BCA 蛋白定量试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司;罗氏TUNEL试剂盒购于北京嘉美纽诺生物科技有限公司;反转录试剂盒购于 Thermo公司;鼠抗Bax、Bcl-2、Fas、FasL抗体购于abcam公司;PCR 引物购于北京诺赛基因组研究中心有限公司。

3 主要仪器 光学显微镜，购于洛阳惠尔纳米科技有限公司;Ultrospec 8000紫外-可见光分光光度计购于通用电气医疗系统贸易发展(上海)有限公司;KD-BM 型包埋机购于金华科迪仪器设备有限公司;组织捣碎匀浆机，购于天津博天胜达科技发展有限公司;高速低温离心机购于sigma公司;Stratagene MX3000P荧光定量 PCR 仪购于安捷伦公司;DF2C 型电泳仪购于北京六一仪器厂。

4 实验方法 从62只大鼠中随机抽取10只大鼠作为空白对照组(A组)，普通饲料喂养，自由饮水，剩余52只建立CAG模型，造模方法：①将150 mg/L的MNNG溶液加入饮用水中，自由饮水；②饥饱失常喂养，即足量喂食2 d，禁食1 d，循环进行；③采用专用夹尾夹夹大鼠尾巴，15 min/(次·d)，以保持愤怒状态，普通饲料喂养，连续8周。然后随机抽取2只大鼠处死，取胃观察胃黏膜形态判断造模是否成功。造模成功，将模型大鼠分为模型组(B组)、胃复春组(C组)、安胃汤低剂量组(D组)、安胃汤中剂量组(E组)、安胃汤高剂量组(F组)。C组给予胃复春悬浊液(将胃复春片研磨后溶于饮用水，制成浓度为0.09 g/ml的悬浊液)，按照0.078g/100(g·d)的剂量灌胃。D、E、F组分别给予0.5、1.0、2.0 g/100(g·d)剂量的安胃汤(将安胃汤颗粒溶于饮用水，制成浓度1.0 g/ml的悬浊液)灌胃。A、B两组给予3 ml生理盐水灌胃。所有大鼠均在每日上午灌胃，连续4周。

5 取材与检测

5.1 取材: 所有大鼠灌胃治疗结束后，继续饲养12周，禁食不禁水12 h后，用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉，剖腹，取出全胃，取四块胃大弯至胃窦部幽门处的胃黏膜组织。

5.2 制备切片: 将 5.1取得的一块胃黏膜组织用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片(厚度为5 μm)，70 ℃烘干30 min，二甲苯中脱蜡10 min，再次脱蜡10 min，梯度乙醇冲洗，洗去二甲苯，然后用蒸馏水洗2 min，苏木精染色5 min，蒸馏水冲洗1 min，1%盐酸酒精分化30 s，蒸馏水中浸泡10 min，伊红染色5 min，蒸馏水冲洗30 s，梯度乙醇脱水各5 min，再用二甲苯透明5 min(2次)，中性树胶封片，光学显微镜下观察胃黏膜组织形态。

5.3 QRT-PCR法检测胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA的表达:将取得的一块胃黏膜组织用Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度法测总RNA浓度在1.8～2.0之间方可用，体外反转录生产cDNA，设计引物进行DNA扩增；引物：Bax: 5’-CGAGCTGATCAGAACCATCA-3’(上游)、5 ’-AAGCCTCAGCCCATCTTCTT-3’(下游)，扩增产物84bp；Bcl-2：5’-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3’(上游)、5＇-CATGCTGGGGCCATATAGTT -3’(下游)，扩增产物86bp；Fas：5’-AAGATCCCGGAAAGCAAGAT-3’(上游)，5’-TAAAGCTTGACACGCACCAG-3’ (下游)，扩增产物349bp；FasL：5’-CAGCAGCCCTTGAATTACC-3’(上游)，5’-CTCCATCAGCACCATGTCC-3’(下游)，扩增产物 285 bp；GAPDH：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTT -3’(上游)、5 ’-TGACGGTGCCATGGAATTTG-3’(下游)，扩增产物93 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃30 s，退火50 ℃1 min，延伸72℃30 s，循环40次，采用相对定量方法的双标准曲线法分析结果，然后计算Ct值，根据出Bax、Bcl-2、Fas、FasL 复制数与GAPDH复制数，得到mRNA的相对表达量。

5.4 Western-blot法检测胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL蛋白的表达：将取得的一块胃黏膜组织采用RIPA组织裂解液提取总蛋白，进行总蛋白定量，计算出上样体积，然后对上样蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后转膜，5 %脱脂乳封闭1 h，一抗Bax、Bcl-2、Fas、FasL、β-actin 1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，二抗1∶3000稀释，室温慢速摇摆孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次，采用ECL试剂盒孵育压片，暗室显影洗片，扫描胶片，测定灰度值度，以β-actin 为参照，计算蛋白相对表达量。

5.5 TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡指数：将取得的一块胃黏膜组织制作石蜡切片，按照TUNEL试剂盒操作说明书进行染色，细胞核呈棕褐色的即为凋亡细胞，光学显微镜下观察细胞凋亡情况，计算凋亡指数=凋亡细胞/视野内细胞总数×100%，每张切片选取5个视野，取平均值。

结 果

1 各组大鼠胃黏膜组织病理改变的比较 A组大鼠胃黏膜结构完整，各层排列正常，固有腺体排列整齐，无萎缩。B组胃黏膜明显萎缩，细胞排列紊乱，不规则，固有腺体萎缩消失，伴变性坏死。C组胃黏膜结构较整齐，固有腺体排列略紊乱，数目有减少。D、E、F组胃黏膜结构完整度呈递增趋势，固有腺体萎缩程度降低，数目增加，明显优于B组(图1)。

2 各组大鼠胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA相对表达量的比较 见表1。与A组相比，B组Bcl-2 mRNA相对表达量降低，Bax、Fas、FasL mRNA相对表达量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与B组相比，C、D、E、F组的Bcl-2 mRNA相对表达量升高，Bax、Fas、FasL mRNA相对表达量降低(P<0.05)；与C组相比， E、F组的Bcl-2 mRNA相对表达量升高，Bax、Fas、FasL mRNA相对表达量降低(P<0.05)；C组与D组之间无明显差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL mRNA相对表达量的比较

注：与A组比较，△P<0.05；与B组比较，▲P<0.05；与C组比较，*P<0.05；与D组比较，◇P<0.05；与E组比较，□P<0.05

3 各组大鼠胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL 蛋白表达量的比较 见表2。与A组相比，B组Bcl-2 蛋白表达量降低，Bax、Fas、FasL 蛋白表达量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与B组相比，C、D、E、F组的Bcl-2 蛋白表达量升高，Bax、Fas、FasL 蛋白表达量降低(P<0.05)；与C组相比， E、F组的Bcl-2 蛋白表达量升高，Bax、Fas、FasL 蛋白表达量降低(P<0.05)；C组与D组之间无明显差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠胃黏膜组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL 蛋白表达量的比较

注：与A组比较，△P<0.05；与B组比较，▲P<0.05；与C组比较，*P<0.05；与D组比较，◇P<0.05；与E组比较，□P<0.05

4 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡指数的比较 见表3。 与A组相比，B组凋亡指数显著升高(P<0.05)；与B组相比，C、D、E、F组凋亡指数均下降(P<0.05)；与C组相比，D、E、F组凋亡指数均下降，且随着剂量的升高，下降程度更明显(P<0.05)。

表3 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡指数的比较(%)

注：与A组比较，△P<0.05；与B组比较，▲P<0.05；与C组比较，*P<0.05；与D组比较，◇P<0.05；与E组比较，□P<0.05

讨 论

目前普遍认为CAG到胃癌的进程是慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-不典型增生-胃癌，主要的发病机制是细胞增殖与凋亡的失衡，细胞凋亡受到凋亡相关蛋白的调控[5]，包括Fas家族、Bcl-2家族与caspase家族等。Bcl-2是Bcl-2家族的抑凋亡因子[6]，胃黏膜细胞的Bcl-2蛋白主要分布于腺体的体部和颈部，随着CAG的进展，Bcl-2蛋白的分布会逐渐覆盖胃黏膜全层，使细胞异常增殖，形成癌变，Bcl-2主要是通过抑制细胞的凋亡，延长细胞生存期。Bax是Bcl-2家族的促凋亡因子，可通过结合Bcl-2，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，因此有学者[7]提出Bax/Bcl-2平衡的失调是胃癌发生的重要机制。Fas是一类跨膜糖蛋白，属于肿瘤杀伤因子(TNF)的超家族成员，主要分布于糖基化的细胞表面，主要促进细胞凋亡。FasL是Fas的配体，与之结合后，可以活化细胞凋亡信号并传递，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用[8]。

CAG到胃癌发展的不同阶段中，胃黏膜细胞的增殖与凋亡平衡是不断变化的。在CAG时，细胞的凋亡与增殖均增加，细胞过度凋亡从而形成黏膜的萎缩改变，而在不典型增生阶段，细胞凋亡障碍，增殖继续增加，从而发生增生[9]。这在本次研究中也得到证实，模型组大鼠抑凋亡因子Bcl-2表达降低，促凋亡因子Bax、Fas、FasL 表达升高，凋亡指数显著升高。

中医根据CAG的临床症状，将其纳入“胃脘痛”、“痞满”等范畴，以痞满居多，早在《伤寒论》就有记载“满而不痛，此为痞”。CAG的病机以脾胃亏虚为主，脾胃虚弱，气血运行紊乱，加上外邪入侵，形成湿毒、火毒，使脾胃经络受损，引发慢性萎缩性胃炎。针对此病机，笔者自拟安胃汤，方中黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效，药理研究显示[10]其具有较强的抑菌、抗肿瘤作用，还能够升高胃蛋白酶原和胃泌素水平，促进胃黏膜生长。百合有清泻胃热的作用，搭配乌药可养津护胃、行气散寒;法半夏和胃，合干姜可降逆燥湿、散瘀开结;白芍柔肝止痛、解郁生津;丹参行气活血，辅以甘草调和诸药，并加强药力。

综上所述，安胃汤治疗CAG大鼠，能够通过调节Bax、Bcl-2、Fas、FasL等细胞凋亡因子水平，抑制胃黏膜细胞凋亡，改善胃黏膜萎缩，效果与安胃汤剂量正相关。但是安胃汤中药理作用复杂，具体是哪些分子发挥调控作用还需要进一步的研究探索。