疏肝补肾法对慢性应激模型小鼠子宫内膜容受性的调节及作用研究*

赵嘉梅， 张爱华，黄紫微,王希浩

1.河南省中医药研究院附属医院妇科(郑州 450000)，2.南京中医药大学(南京210023)

主题词 不育, 女性/中医药疗法 @疏肝补肾 动物实验 小鼠

我国女性从事社会活动、工作的比例不断上升，随着全社会经济的飞速发展，我国居民生活、工作节奏日益加快[1-3]。长期慢性应激状态使部分女性在生理、心理等多重慢性刺激作用下发生了不同程度的排卵功能障碍、黄体功能异常、子宫内膜容受性(Endometrial receptivity，ER)受损等生理病变[4-6]。从而对妊娠需求、生理健康以及心理等形成了不良影响。西医西药为对症治疗模式，对于慢性刺激所至的子宫内膜容受性降低而形成的相关疾病尚无特效疗法。中医理论认为本病属于“肝郁证”的范畴。为了深入研究中医疏肝补肾中药对于慢性应激性子宫内膜容受性减低而诱发的不孕症，我们选取疏肝补肾经典方药，开展本次动物建模实验,现将详细研究内容与结果总结于后文。

资料与方法

1 实验动物 自河南省实验动物中心购进SPF级的KM雄性小鼠50只，日龄为28～32 d；SPF级的KM雌性小鼠80只，日龄为21～28 d,许可证号：SCK(豫)2015-0002，合格证号：No.41003100002729。

2 实验用药 逍遥丸(国药准字Z41021831)，配制为浓度0.3 g/ml的混悬液备用；滋肾育胎丸(国药准字Z44020008)，配制为浓度0.3 g/ml的混悬液备用。疏肝补肾中药，方剂组成：菟丝子、仙灵脾、肉苁蓉各30 g，熟地20 g，山萸肉、枸杞子、当归、生白芍、制香附各15 g，柴胡、鹿角霜、制龟版、炒白术各12 g，鸡内金9 g；孕后方，方剂组成：黄芪、熟地、菟丝子各30 g，生白芍、党参、炒白术、枸杞子各15 g，川断、杜仲、桑寄生各12 g，柴胡、紫苏梗、黄芩各9 g，砂仁6 g；以上药材生药按原方剂量20倍取材制剂，制成1.21 g/ml流浸膏备用。上述中药材均购自同仁堂中药饮片有限公司。

3 建模与分组方法 自全部雌鼠中随机选取20只归入空白组，其余60只制备为慢性应激小鼠模型。空白组选取15只精神状态良好的雌鼠进入下一阶段实验；自60只慢性应激小鼠模型中选取45只建模最为成功的随机均分为模型组、阳性对照组与中药观察组进入下一阶段实验。

慢性应激小鼠模型依据相关文献方法制备[7]。对60只雌性小鼠给予慢性刺激持续21 d，刺激操作包括：15 min起动～300次/min振幅为20 MM的水平震荡、24 h禁水、24 h禁食、以150 ml纯净水注入笼底垫料使垫料保持湿润24 h、束缚3 h、10 MA的10 S/次足底电刺激间隔30 s连续20次、24 h昼夜颠倒、有威胁性的陌生气味、40DB的10 S/次噪音刺激间隔30 s连续20次等刺激，每天随机进行一种刺激，每种刺激重复3次。刺激结束后，对60只小鼠进行旷场试验、悬尾试验、称量体重；旷场试验，记录小鼠在3 min内完成的水平穿格数、在中央格的停留时间、直立的次数、修饰的次数、粪粒数；悬尾实验，固定小鼠尾部，使其在三面封闭环境下倒置悬挂6 min，记录倒悬后4 min内的静止时间；通过统计上述数据进行分析确定建模成功。

4 实验方法 空白组15只小鼠持续常规喂养，正常饮食、休息、活动，保持健康，不予任何药物干预，持续21 d后合笼，至见栓后第5天。模型组15只小鼠于建模成功后持续常规喂养，喂养方法与空白组相同，不予任何药物干预，持续21 d后合笼，至见栓后第5天。观察组于建模成功后给予疏肝补肾中药流浸膏，按1 ml/100 g(体重)灌胃，持续21 d后合笼，合笼后给予孕后方按1 ml/100 g(体重)灌胃至见栓后第5天。阳性对照组于建模成功后给予逍遥丸混悬液，按1 ml/100g灌胃，持续21 d后合笼，合笼后给予滋肾育胎丸混悬液按1 ml/100 g(体重)灌胃至见栓后第5天。

5 观察指标与方法 观察组各组小鼠建模后21 d时的体重及行为学指标：中央格停留时间、水平穿格数、直立次数、悬尾静止时间。实验结束后统计见栓率与着床数以及子宫内膜VEGF、LIF的表达水平。

各组小鼠均于建模后21 d晚按1∶1比例与雄性小鼠合笼，见阴栓日记为妊娠第1 d，未见阴栓的连续合笼5天至见到阴栓为止。于妊娠第5 d晨，以后颈椎脱臼法将各组小鼠处死，解剖后统计着床数并取子宫内膜，制作石蜡切片以免疫组化法于高倍电子显微镜下观察VEGF、LIF在子宫内膜的表达水平。

6 统计学方法 全部实验数据均录入至SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量数据以Kolmogorov-Smirnov检验分布状态，以单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验差异性，进一步两两对比采取LSD-L分析，符合正态分布的数据以Mean±SD表述，偏态分布数据以M×25%～×75%)表述；计数数据以卡方检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组行为学指标比较 见表1。各组间中央格停留时间、水平穿格数、直立次数、悬尾静止时间差异具有统计学意义(P<0.05)；经进一步两两对比，各组间各项行为学指标差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2 各组见栓率与着床数比较 见表2。各组间见栓率差异具有统计学意义(P<0.05)，进一步对比观察组与空白组、模型组与阳性对照组间见栓率无统计学差异(P>0.05)；其余各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)；观察组胚胎着床数高于其它各组，各组间胚胎着床数两两对比差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组间行为学指标比较

注：与空白组对比，☆P<0.05；与模型组对比，★P<0.05；与阳性对照组对比，◇P<0.05

表2 各组见栓率与胚胎着床数比较

注：与空白组对比，☆P<0.05；与模型组对比，★P<0.05；与阳性对照组对比，◇P<0.05

3 各组子宫内膜VEGF、LIF表达水平比较 见表4。各组子宫内膜VEGF、LIF表达水平比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；进一步两两对比，各组间子宫内膜VEGF、LIF表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组间LIF、VEGF对比(光度值)

注：与空白组对比，☆P<0.05；与模型组对比，★P<0.05；与阳性对照组对比，◇P<0.05

讨 论

在生活节奏日益加快、各种压力逐渐增强的现代社会中，女性的社会活动日益频繁，承担的压力也更加多元化。长期处于这种应激状态下，部分女性的生殖系统可发生不同程度的病理改变。在不孕症的临床上约有5%左右与精神应激因素相关，而在不孕症女性患者中约有50%以上的患者合并有不同程度的心理症状[8-10]。外界的刺激、不孕症形成的心理压力使患者的神经内分泌、免疫功能以及生殖系统等发生应激反应。部分患者逐步形成生殖内分泌系统的慢性应激性损害。因此，慢性应激反应已经成为了生殖内分泌系列疾病的一种主要诱因。临床主要表现为月经不调、妇科炎性疾病、复发性流产、不孕等诸多生殖障碍性病变，对患者的身心健康均构成不良影响[11-13]。现代西医学认为，心理应激反应可诱发下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能亢进，使肾上腺皮质激素的分泌异常升高，抑制了β-内啡肽、下丘脑多巴胺以及5-羟色胺等的合成，使血清中泌乳素的含量升高，从而对卵巢甾体激素的分泌合成形成干扰，最终形成了生殖功能障碍[14-15]。ER是子宫内膜在正常月经周期中的特定的一段极短时间内允许胚胎侵入、黏附以及着床的开放功能，这一段极短时间为“着床期”、“窗口期”。胞饮突、同源框基因(Homeoboxgene，HOX)表达、局部激素分泌异常、细胞因子表达改变、免疫功能异常以及应激反应等均可对ER构成影响。

中医学理论认为情志异常而形成的生殖系统病变或功能障碍等均属于“肝郁”、“情志失调”等范畴。中医理论认为本病盖因肝郁不舒加之脾肾羸弱或后天失养，或有情志失调、饮食不节等而致的肝郁、肾亏、脾弱、血虚而形成本病。因此治疗应以疏肝补肾、养血益气、健脾固中为主。我们以疏肝补肾中药对慢性应激小鼠进行治疗效果理想。疏肝补肾方中菟丝子润养肝肾、生精益血、通调经络；柴胡、熟地、生白芍具有滋阴补血、疏肝健脾之功；柴胡入气分、解郁疏肝、升阳；熟地温润柔肝，滋阴养血、益髓生精；白芍敛阴固津、柔肝养血；枸杞子平补精血、养肾柔肝；山萸肉温养精气、固涩荣血；当归行血、补血；鹿角胶补益精血、温阳补肾、荣筋强骨；制龟版凉血补心、润燥养阴；仙灵脾调理冲任，可发挥理气疏肝、补肾养阴之功；制香附味辛、微苦，性平，入肝经之气分，可疏肝解郁，降逆泄火；鹿角霜温补肾阳、止血固敛，主治脾肾阳虚、纳差恶心、崩漏血沥等症；肉苁蓉味甘、咸，可益肾补阳、润肠通便，为补益阳精之要药；白术健脾祛湿、补气滋阴，利于水谷精微全身运化生血之功；鸡内金味甘、性平，健胃补脾、消积化食，促进诸药吸收。诸药共用可益气健脾、补肾疏肝、滋阴养血、条达气机、充盈气血之功。

通过本次研究证明，通过疏肝补肾中药治疗21 d后，观察组小鼠的各项行为学指标优于阳性对照组与模型组，但与空白组的健康小鼠仍有一定差距，提示21d治疗周期尚无法使慢性应激小鼠完全恢复至正常水平，通过延长治疗有望达到正常标准。而阳性对照组小鼠的各项行为学指标优于模型组，说明逍遥丸能够改善应激小鼠的行为学指标，但未能达到观察组水平，提示疏肝补肾中药对于改善应激小鼠行为学指标的效果较逍遥丸更为理想。观察组的见栓率与胚胎着床率均高于模型组与阳性对照组，提示通过疏肝补肾中药治疗慢性应激小鼠的妊娠功能可达到甚至优于普通健康小鼠，说明疏肝补肾中药具有明确的改善慢性应激小鼠子宫内膜容受性与妊娠能力的作用，且作用优于逍遥丸治疗。

综上所述，疏肝补肾中药在改善慢性应激性小鼠子宫内膜容受性方面具有明确疗效，能够有效改善慢性应激模型小鼠子宫内膜VEGF及LIF表达水平从而改善子宫微环境，提高妊娠成功率。