采用二代测序技术对卵圆孔未闭家系进行基因突变筛查与分析

杜 媛,韩 秀,彭丹亚,王 强,李 娟,殷艳蓉*

(1西安交通大学第一附属医院心血管内科,陕西省分子心脏病学重点实验室,环境与疾病相关教育部重点实验室,西安 710061;2陕西省丹凤县人民医院内三科;*通讯作者,E-mail:yronger@163.com)

卵圆孔是胚胎时期心脏房间隔的一个生理性通道,一般在生后第1年闭合,若大于3岁的幼儿卵圆孔仍未闭合称卵圆孔未闭(patent foramen ovale,PFO)[1]。PFO是目前成人中最为常见的先天性心脏异常,成年人中有20%-25%的卵圆孔不完全闭合[2]。长期以来人们认为PFO是一种解剖变异,一般对心脏的血流动力学无明显影响,临床上并无重要意义,然而,近年来越来越多的研究发现,PFO患者发生脑卒中、偏头痛、外周动脉栓塞、阻塞性睡眠呼吸暂停、斜卧呼吸-直立性低氧血症综合征、减压病等的风险较正常人群呈数倍升高[3-5]。近期我们发现一个家族中多人罹患PFO,遂利用二代测序法对该家族罹患PFO成员进行遗传筛查,以期发现可能的致病基因。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究获得西安交通大学第一附属医院伦理委员会的批准,研究对象为1例PFO家系所有成员,所有研究对象均签署了知情同意书。临床资料包括病史采集、体格查体、12导联心电图、经胸心动超声以及右心声学造影等,在行心动超声及右心声学造影检查的过程中嘱患者行Valsalva动作以便于观察心房水平右向左分流;部分研究对象还进一步行经颅多普勒(TCD)发泡实验。

右心声学造影的阳性结果判断标准:造影后逐帧回放并观察记录右心房充分显影后前3个心动周期每帧图像上进入左心房的微泡数量,并依此将PFO右向左分流半定量化,分为以下3个等级:Ⅰ级(少量右向左分流):左心房内可见1-10个微泡/帧;Ⅱ级(中量右向左分流):左心房内可见11-30个微泡/帧;Ⅲ级(大量右向左分流):左心房内可见>30个微泡/帧,或左心房几乎充满微泡,导致左心腔内透声差[6]。TCD发泡实验的阳性结果判断标准(1999年威尼斯会议推荐标准),以10 s内出现微气泡信号作为阳性标准,根据微气泡数量进行分级:Ⅰ级,无微气泡信号(阴性结果);Ⅱ级,1-10个微气泡信号;Ⅲ级,大于10个但未形成“雨帘”;Ⅳ级,形成“雨帘”[7]。

1.2 遗传基因筛查

从受检者外周血中提取基因组DNA,经片段化、连接接头、扩增纯化后,使用SeqCap EZ MedExome Kit(Roche NimbleGen)杂交捕获人类全部基因的外显子区及相邻内含子区域(50 bp),捕获到的DNA经洗脱和扩增纯化后,使用高通量测序仪(Illumina)进行测序。测序数据采用NextGene V2.3.4软件与UCSC hg19人类参考基因组序列进行比对和鉴别遗传变异,并收集目标区域的覆盖度和平均测序深度等质量参数。筛选获得的遗传变异均通过Sanger测序法进行验证。

2 结果

2.1 家系临床资料分析

如图1所示,该家系有血缘关系的9人中共7人被证实患有PFO。其中先证者(Ⅱ-4)为46岁女性,因突发左侧肢体麻木伴言语不利入院检查。既往否认高血压、糖尿病及高脂血症等病史。头颅CT示:右侧颞叶脑梗死;经颅多普勒(TCD)发泡实验显示右侧大脑中动脉双深度血流信号,注射激荡盐水静息状态下及行Valsalva动作后10 s内监测到大量(帘状)微栓子信号;右心声学造影:静息状态下右心显影后第2个心动周期左心内可见大量微气泡显影(密度较低),行Valsalva动作后即刻左心内探及大量微气泡(整个心腔浑浊)。以上结果证明PFO。遂行卵圆孔封堵术(Amplatzer 25 mm PFO封堵器)。双下肢静脉超声示:左侧髂外、股总、右侧大隐静脉瓣功能不全。

图1 PFO家系图Figure 1 Pedigree structure of the PFO family

表1显示,先证者的姐姐(Ⅱ-2),女48岁,平素无头晕、头痛,无突发言语不利、肢体活动不灵等。既往有高血压病史6年,药物控制良好。访视中行心动超声及右心声学造影发现PFO,进一步行TCD发泡实验为阳性。已行卵圆孔封堵术。先证者的妹妹(Ⅱ-6),女,44岁。有发作性头痛病史5年,行心动超声、TCD发泡实验及右心声学造影,均证实存在PFO,亦行卵圆孔封堵术。

表1该PFO家系成员临床资料

Table1ClinicalcharacteristicsofthePFOfamilymembers

研究对象性别年龄(岁) 临床症状经右心声学造影Ⅰ-1男-63岁死于贲门癌-Ⅰ-2女-61岁死于脑出血-Ⅱ-2女48无明显不适PFOⅡ-4(先证者)女46突发脑梗PFOⅡ-6女44发作性头痛PFOⅡ-7男42无明显不适PFOⅢ-1女24无明显不适PFOⅢ-2女19无明显不适PFOⅢ-3男17无明显不适阴性Ⅲ-4女17无明显不适PFOⅢ-5女9无明显不适阴性

其他家庭成员中,先证者的弟弟(Ⅱ-7,男,42岁),女儿(Ⅲ-2,女,19岁)、外甥女(Ⅲ-1,女,24岁)、侄女(Ⅲ-4,女,17岁)平素均无明显不适,此次访视中普通经胸心动超声未见明显心脏结构异常,右心声学造影示行Valsalva动作后即刻左心内探及大量微气泡,证实存在PFO。其中,先证者外甥女(Ⅲ-1,女,24岁)行右心声学造影时在静息状态下右心显影后第二个心动周期左心内可见中-大量微气泡显影(40-50个/帧),需手术治疗。先证者另一侄女(Ⅲ-5,女,9岁)、外甥(Ⅲ-3,男,17岁)未诉不适,此次心动超声及右心声学造影均未发现PFO。

2.2 测序结果分析

对该PFO家系中所有患者进行二代基因测序后未发现可以解释PFO患者主要临床表型的致病/疑似致病性变异,也未发现与其他表现有PFO的综合征相关的基因存在异常。

3 讨论

卵圆孔是胚胎时期心脏房间隔的一个生理性通道,出生后大多数人因肺膨胀致左房压力增高,使得原发隔和继发隔相互靠近、粘连、融合,逐渐形成永久性房间隔,若未融合则形成PFO。62%的新生儿在出生的前60 h内存在PFO[8],普通人群中接近30%成人存在PFO。

本研究的家系里有血缘关系的9人中,共7人发现卵圆孔未闭,PFO的患病率为77.8%(7/9)。Del Sette等[9]报道了1例53岁女性因脑卒中而发现患有PFO,随后其同卵双胞胎姐妹在访视中也被检查出存在PFO。这些报道说明PFO确实有一定的家族聚集性。Arquizan等[10]对62例缺血性脑卒中患者及62例患者同胞对照进行TCD检查,结果发现PFO患者其同胞的PFO患病率高达61.5%,远远高于那些非PFO患者的同胞(30.6%)。而且女性患者的这种差异更为明显,女性患者同胞PFO的患病率达76.5%,非PFO女性患者同胞患病率为25%[10]。本研究结果与该结果相一致。

成人中PFO持续存在的原因尚不明确,而PFO的这种家族聚集性特征则提示PFO的形成可能与遗传基础异常有关,故我们对这一PFO家系成员进行了基因筛查。胎儿房间隔的发育受基因调控,房间隔缺损(atrial septal defect,ASD)和PFO是同一解剖及病理连续性的一部分,故可能拥有共同的遗传基础。同一家系下有的家庭成员表现为ASD,有的则为PFO[11]。现已发现,与ASD有关的人类基因突变有NKX2-5、TBX5、GATA4、MYH6及ACTC[12],目前为止,在人类中尚未见这些基因与PFO有关的报道。而小鼠的动物实验发现,NKX2-5突变导致66%-68%的突变株发生PFO[13]。NKX2-5基因在胎儿心脏间隔发育以及房室结成熟中发挥重要作用,而且NKX2-5作为心脏转录因子广为人知,是第一个被发现的心脏前体细胞标志物[14]。Belvís等[15]对脑卒中患者外周血白细胞进行DNA测序,旨在探讨脑卒中患者中NKX2-5突变是否与存在PFO有关，结果显示,在34名存在PFO的脑卒中患者的外周血DNA中几乎未能检测到该基因的病理性突变。该研究者认为,出生后NKX2-5基因表达局限于心脏,故不能排除PFO患者存在NKX2-5基因的体细胞突变(somatic mutation)可能[15]。Gollob等[16]检测15例特发性房颤患者后发现3例患者存在GJA5基因新的杂合子错义突变,该突变仅存在于心脏组织而不存在于淋巴细胞,提示体细胞突变。因此,体细胞突变可能也是本研究未能在PFO患者的外周血中检测到PFO相关基因突变的原因之一。

由于二代测序方法本身的局限性,外显子测序可以检测单个核苷酸变异(SNV)和小片段缺失/插入变异(small indels),不适用于发现如下变异:基因大片段拷贝数变异,动态变异、基因组的复杂重组与结构变异,以及位于基因调节区、深度内含子区、长片段重复序列以及存在高度同源序列区域的变异[17]。此外,对于遗传变异的解读,高度依赖于临床表型信息和临床诊断,以及现有数据库收录的信息和已发表的文献资料。而本研究中的测序仅仅针对已知的与疾病明确相关的基因,未检测到任何可以解释临床表型的遗传变异也并不能完全排除遗传致病性因素,仍然可能存在有其他未知基因。

总之,本研究报道的PFO家系家族聚集性提示可能存在遗传基因的异常,虽然采用外显子测序进行基因筛查结果为阴性,但不能排除体细胞突变或其他遗传因素影响的可能,进一步的随访检测寻找致病基因对于该家系患者仍尤为重要。