姜黄素通过活化PI3K/Akt信号通路逆转肝癌耐药细胞株Bel7402/ADR的耐药性

魏 蔚 刘玉华

(平顶山学院医学院，河南 平顶山 467000)

肝癌是世界上对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，死亡率极高〔1〕。而我国是肝癌的高发地区之一，每年新增病例占全世界的一半以上〔2〕。肝癌的高死亡率主要原因是其起病隐匿、发病机制复杂、极易扩散，从而限制了肝癌患者的早期诊断和治疗〔3，4〕。目前临床上治疗肝癌的主要方法仍然是手术切除，但是当患者被确诊时，已是晚期，全身扩散，错过了切除的最佳时机〔5，6〕。因此，往往需要辅以全身化疗和放疗。但是化疗会导致肝癌的多药耐药性，使化疗的效果大大降低而达不到预期疗效〔7，8〕。寻找有效的耐药逆转药物对肝癌的化疗和预后具有极其重要的意义。目前国内外研发了大量的西药逆转试剂，但其毒性明显或者效果不佳而很难在临床上推广〔9，10〕。因此，研究者们将目光转向了低毒高效的中药制剂。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种酚类色素，据现有资料报道，其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等广泛的药理作用，其对正常组织毒性低〔11～13〕。目前国内外研究普遍认为姜黄素的抗肿瘤作用机制可能主要与抑制肿瘤细胞的生长和增殖、诱导肿瘤细胞凋亡有关〔14～16〕。此外，姜黄素可以增强化疗药物的敏感性，姜黄素可以有效逆转结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌等多药耐药细胞的耐药性〔17～19〕。但是姜黄素能否逆转肝癌细胞对耐常见化疗药物阿霉素的耐药性，目前国内外这方面的研究尚少。本文探讨姜黄素能否逆转人肝癌细胞株对阿霉素耐药性及逆转的可能机制，为肝癌的耐药临床逆转提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验药物 阿霉素(货号：25316-40-9，含量≥99.8%，北京诺其雅生物科技有限公司)；姜黄素(货号：458-37-7，含量≥99.5%，北京索莱宝科技有限公司)；LY294002(货号：154447-36-6，含量≥99%，北京启维益成科技有限公司)。

1.2主要试剂 MTT细胞活力检测试剂盒购买于上海中乔新舟生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培养液、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)均购买自美国HyClone公司；二甲基亚砜(DMSO)、Annexin-V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海阿拉丁生物试剂公司；磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)蛋白抗体购买于美国Neomarker公司；β-actin抗体购买于美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物标记的二抗购买于武汉博士德生物公司；电化学发光(ECL)试剂及其他蛋白质印迹实验试剂均购买上海阿拉丁试剂公司。

1.3细胞系与动物肿瘤模型构建 人肝癌细胞株Bel7402购买于上海细胞库，采用常规细胞培养方法培养。人肝癌耐药细胞株Bel7402/ADR在本实验室中采用阿霉素药物浓度递增法诱导获得。取对数生长期Bel7402细胞，接种于培养瓶中，待细胞贴壁后，将培养基更换为含10 μg/ml阿霉素的新鲜培养基，并持续培养3 d，然后弃掉上清和死亡漂浮的细胞，重复上述步骤，培养2个月后，将细胞放入含0.1 μg/ml阿霉素的培养基中稳定培养，获得Bel7402/ADR细胞。Balb/c裸鼠(3～5周龄，雌性，15～20 g，SPF级)购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房中。取对数生长期Bel7402/ADR细胞，消化后用PBS重悬细胞，并以106/ml的细胞密度接种到小鼠后背皮下，每只注射150 μl含细胞PBS，放动物房中继续饲养。大约10 d后，用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积=长×宽2÷2。肿瘤大小大约为80 mm3时用于后续试验。

1.4实验方法

1.4.1MTT法检测细胞活性 取对数生长期Bel7402和Bel7402/ADR细胞，消化后分别以105/ml密度接种到96孔板中培养24 h，弃掉旧培养，分别加入含不同浓度阿霉素和姜黄素及阿霉素和姜黄素联合药物的新鲜培养基继续培养24 h，每个实验组4个复孔，弃掉含药培养基，每孔加入MTT溶液(浓度为5 mg/ml)50 μl培养4 h，小心弃去上清，每孔加入200 μl DMSO，震荡溶解沉淀，酶标仪在波长492 nm下读取吸光度值。计算药物对两种细胞的半数抑制浓度(IC50)值及耐药指数(KI)。RI=IC50(Bel7402/ADR)/IC50(Bel7402)。

1.4.2细胞凋亡检测 实验分为阿霉素组、5 μg/ml姜黄素组、10 μg/ml姜黄素组，每个实验组4个复孔。将姜黄素和阿霉素加入对数生长期的各组细胞中，培养24 h后，用胰酶消化液消化细胞，通过离心(1 500 r/min，3 min)收集细胞。所得细胞按细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤操作，PBS洗细胞2次后，加入400 μl预冷PBS，然后分别加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，4℃避光孵育30 min后，立即用流式细胞仪测定，经计算机软件处理后，计算出凋亡细胞的百分率。

1.4.3Western印迹检测细胞中PI3K/Akt蛋白表达水平 取对数生长期Bel7402和Bel7402/ADR细胞，以104/ml密度接种到培养瓶中，培养24 h，每个实验组3个复瓶。实验分为5个组：Bel7402细胞组、Bel7402/ADR细胞+阿霉素组、素霉素+LY294002组、阿霉素+5 μg/ml姜黄素组、阿霉素+10 μg/ml 姜黄素组。培养24 h后，弃掉旧培养液，消化细胞并通过低速离心收集细胞，提取细胞总蛋白。采用Bradford方法进行蛋白定量，煮沸样本5 min，冰上冷却后离心30 s，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V下转膜1 h，使用0.5%(W/V)脱脂牛奶室温封闭聚偏二氟乙烯(PVDF)膜1 h，在4℃下，用PI3K和Akt蛋白一抗孵育过夜，再用0.1%(V/V)TBST洗膜2次后，在室温下，孵育荧光素标记的二抗1 h，洗膜3次后即用ECL显色剂曝光，并用扫膜仪进行成像。

1.4.4姜黄素对Bel7402/ADR荷瘤鼠肿瘤治疗的检测 将Bel7402/ADR荷瘤鼠随机分为四组：生理盐水组、阿霉素组、5 μg/ml姜黄素组、10 μg/ml姜黄素组。分别通过小鼠尾静脉给药，给药后，每隔2 d检测一次小鼠肿瘤体积，并对小鼠进行称重。

1.4.5在体组织学检测 荷瘤鼠经过不同药物处理30 d后，处死小鼠，取出主要脏器，包括心、肝、脾、肺、肾。立即用10%甲醛溶液浸泡过夜，不同体积浓度的无水乙醇脱水后，将组织块浸泡到二甲苯中30 min。再将组织块浸泡在50～60℃的石蜡中2 h，然后和石蜡一起倒入包埋框里，待冷却后，放入石蜡切片机切片，厚度为5 mm。最后用苏木精和伊红分别进行染色，并在光学显微镜下观察组织结构，数码相机拍照。

1.5统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1MTT法检测Bel7402/ADR细胞对阿霉素的敏感性 阿霉素对Bel7402和Bel7402/ADR细胞的IC50值分别为(62.3±3.1)和(1 514.6±12.6)μg/ml，Bel7402/ADR对阿霉素表现了高度的耐药性，RI为24.3。

2.2姜黄素对Bel7402/ADR细胞活性的影响 如表1所示，0～100 μg/ml姜黄素对Bel7402和Bel7402/ADR细胞活性均有浓度依赖性抑制效果。姜黄素对Bel7402和Bel7402/ADR细胞的IC50值分别为：(95.8±3.9)μg/ml和(101.4±3.1)μg/ml。本实验中规定细胞抑制率小于10%的药物剂量为无毒剂量，因此姜黄素对Bel7402/ADR细胞的无毒剂量为5和10 μg/ml。

2.3姜黄素对Bel7402/ADR细胞耐药逆转的作用 无毒剂量5 μg/ml和10 μg/ml姜黄素分别联合阿霉素对Bel7402/ADR细胞的IC50值分别为(769.4±14.9)和(431.8±9.8)μg/ml，对Bel7402/ADR的耐药逆转倍数分别为1.97和3.51倍，随着姜黄素浓度的提高，逆转效果越明显。

表1 姜黄素对Bel7402/ADR细胞活性的影响

与0 μg/ml组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率 阿霉素几乎不能诱导Bel7402/ADR细胞凋亡〔凋亡率为(3.9±1.2)%〕，分别联合无毒剂量5和10 μg/ml姜黄素后，诱导的凋亡率分别为(15.8±2.4)%和(27.3±1.9)%，说明姜黄素逆转了Bel7402/ADR细胞的耐药性，并诱导细胞凋亡。

2.5Western印迹检测PI3K/Akt蛋白的表达 如图1所示，Bel7402细胞中PI3K/Akt蛋白的表达含量很少，显著低于Bel7402/ADR细胞中的表达含量(P<0.01)。用PI3K/Akt蛋白表达抑制剂LY294002预处理Bel7402/ADR细胞后，发现PI3K/Akt蛋白的表达被显著抑制(P<0.01)。Bel7402/ADR细胞分别加上5和10 μg/ml姜黄素处理24 h后，细胞内PI3K/Akt蛋白的表达含量随着姜黄素的升高而降低，相比单独的Bel7402/ADR细胞中的PI3K/Akt蛋白的表达含量差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表2。

图1 各组细胞中PI3K/AKT蛋白的表达比较

PI3KAKTBel7402细胞0.12±0.062)0.15±0.0452)Bel7402/ADR细胞 阿霉素组0.89±0.090.75±0.078 LY294002组0.24±0.0582)0.21±0.0242) 5 μg/ml姜黄素组0.56±0.0351)0.37±0.0162) 10 μg/ml姜黄素组0.35±0.0322)0.29±0.0242)

与阿霉素组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.6姜黄素联合阿霉素体内抑制皮下移植瘤的作用 如图2所示，单独的阿霉素处理荷瘤小鼠，对小鼠的肿瘤生长基本没有抑制作用，说明在体Bel7402/ADR细胞对阿霉素具有很强的耐药性。联合无毒剂量5和10 μg/ml姜黄素后，肿瘤体积得到显著抑制，随着姜黄素的浓度升高，抑制效果愈加显著(P<0.01)。

2.7姜黄素联合阿霉素体内对小鼠的毒理学研究 通过检测小鼠体重来反映药物对小鼠健康的影响，如图3所示，单独的阿霉素、5 μg/ml姜黄素、10 μg/ml姜黄素对小鼠体重增长均无明显影响。30 d的治疗期接受后，单独的阿霉素、5 μg/ml姜黄素、10 μg/ml姜黄素对小鼠主要脏器均无明显损伤(图4，5)，说明，本实验中采用的药物剂量均在安全范围之内。

与阿霉素组比较:1)P<0.01图2 姜黄素联合阿霉素对肿瘤体积的影响

图3 姜黄素联合阿霉素对小鼠体重的影响

图4 姜黄素联合阿霉素对小鼠心脏组织的影响(HE，×100)

图5 HE染色检测姜黄素联合阿霉素对小鼠肝脏、脾脏、肺、肾脏组织的影响(HE，×100)

3 讨 论

细胞耐药是指肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生很强的抗药性，从而大大降低化疗药物的治疗效果〔20，21〕。阿霉素是一种广谱的抗瘤药物，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，研究表明单独或者联合化疗方案对恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、成骨肉瘤、膀胱癌、肝癌等多种癌症均已取得显著的疗效，但耐药的产生，导致化疗的失败，而限制了阿霉素的应用〔22～25〕。PI3K/Akt信号转导通路广泛存在细胞中，参与细胞的生长、增殖及分化〔26，27〕。有研究表明PI3K/Akt信号通路在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Akt是该通路的活性中心，其活性的升高可以抑制细胞的凋亡〔28，29〕。阿霉素和细胞 DNA 结合后，DNA 损伤信息激活了PI3K/Akt信号通路，导致细胞凋亡的抑制，因此高表达PI3K/Akt则引起细胞凋亡阈值的增高，导致升高细胞对阿霉素引起的凋亡的耐受性〔30〕。本实验从体外和体内两方面考察了姜黄素对肝癌逆转耐药的作用，提示姜黄素可以显著的逆转肝癌细胞对阿霉素的耐药性，并增强阿霉素诱导的细胞凋亡。其耐药机制可能是姜黄素抑制了PI3K/Akt蛋白的高表达，从而降低了阿霉素诱导的细胞凋亡阈值。由此，我们可以预见姜黄素有可能作为一种新的肝癌细胞多药耐药的逆转剂，具有较广阔的应用前景。