上调miR-124表达诱导甲状腺癌细胞凋亡的作用及其机制

金 洁 任跃忠 林海洋

(浙江大学医学院附属第二医院内分泌科，浙江 杭州 310009)

甲状腺癌根据组织发生和形态结构的不同可分为乳头状腺癌、滤泡性癌、髓样癌和未分化癌，其中乳头状腺癌最常见〔1,2〕。目前，关于甲状腺癌的诊断和治疗手段比较单一，且治疗效果并不理想。微小RNA(miRNA)是一类通过与下游基因mRNA互补配对，导致靶基因mRNA降解和蛋白翻译受阻的内源性小分子RNA，大量研究显示miRNAs与肿瘤的发生发展密切相关〔3,4〕。miR-124在胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等多数肿瘤中具有抑癌作用，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡过程中具有重要作用〔5～7〕，但其对甲状腺癌的作用机制尚不清晰。本文拟分析miR-124对甲状腺癌细胞凋亡的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1主要材料与仪器 正常甲状腺细胞系Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞系SW579由中国科学院细胞库提供。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、链霉素和RPMI1640培养液购于美国Sigma公司。

Has-miR-124 mimics、Has-miR-124 mimics NC和PCR扩增引物购于广州锐博公司。RNAiso Plus试剂盒为日本TaKaRa公司产品，反转录试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量检测试剂盒、膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒和放射免疫沉淀(RIPA)细胞裂解液为上海碧云天公司产品。B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、蛋白激酶B(AKT)抗体、磷酸化AKT(p-AKT)抗体、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(PIK3CA)、β肌动蛋白(β-actin)抗体和辣过氧化物酶标记羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗为美国Cell Signaling Technology公司产品。细胞培养箱、PCR仪和流式细胞仪为美国Thermo公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养 取储存在液氮罐中的Nthy-ori3-1细胞和SW579细胞，迅速置于温度为37℃的水浴锅中融化复苏。向收集到的细胞悬液中加入含有10%FBS、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2和95%湿度的培养箱中常规培养，每2天更换1次培养液，待细胞成长完全贴壁后，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2实时荧光定量(qRT)-PCR检测 收集培养至对数生长期的Nthy-ori3-1细胞和SW579细胞，采用RNAiso Plus试剂盒提取两种细胞的总蛋白。采用反转录试剂盒获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。miR-124上游引物为5′-TTTTAAGGCACGCGGTG-3′，下游引物为5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。其中，PCR扩增条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(共35个循环)；72℃总延伸300 s。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miR-124的表达水平，每组实验重复3次。

1.2.3细胞分组及转染 转染前24 h，收集培养对数生长期的SW579细胞，随机分为空白对照组、阴性对照组和miR-124模拟组。空白对照组不做任何处理，阴性对照组加入Has-miR-124 mimics NC和Lipofectamine2000进行转染，miR-124模拟组加入Has-miR-124 mimics和Lipofectamine2000进行转染，具体操作步骤按照Lipofectamine2000试剂转染说明书进行。

1.2.4转染效果检测 上述各组SW579细胞转染6 h后，更换1次培养液，置于细胞培养箱中常规培养48 h。收集空白对照组、阴性对照组和miR-124模拟组对数生长期细胞，按照1.2.2中的操作步骤观察各组细胞中miR-124的表达水平，检测其转染效果。

1.2.5Western印迹检测 收集转染48 h的空白对照组、阴性对照组和miR-124模拟组对数生长期细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，根据BCA检测试剂盒检测各组细胞总蛋白的浓度和纯度。以每孔蛋白样品30 μg上样至浓度为10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中，电泳完毕后，经转印、封闭后加入Bax抗体(1∶800稀释)、Bcl-2抗体(1∶800稀释)、AKT抗体(1∶1 000稀释)、p-AKT抗体(1∶1 000稀释)、PIK3CA抗体(1∶1 000稀释)和β-actin抗体(1∶1 000稀释)，在4℃条件下孵育24 h后，加入二抗(1∶2 000稀释)，常温条件下反应2 h后，以化学发光法显色，曝光，采用凝胶电泳成像仪分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.2.6流式细胞仪检测 收集转染48 h的空白对照组、阴性对照组和miR-124模拟组细胞，调整细胞浓度为5×104个/ml后接种至6孔板中，经0.25%胰蛋白酶消化后，预冷的磷酸盐缓冲液洗涤、离心。每组取1 ml细胞，洗涤离心后加入200 μl结合缓冲液重悬细胞，每100 μl分别加入Annexin V、PI体积为5 μl和10 μl，混匀后避光条件下反应10 min，再加入400 μl结合缓冲液，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.3统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-124在甲状腺癌SW579细胞中的表达 miR-124在正常甲状腺Nthy-ori3-1细胞中的表达量(1.02±0.03)明显高于在SW579细胞中(0.32±0.05；t=20.793，P<0.05)。

2.2转染Has-miR-124 mimics上调SW579细胞中miR-124表达 转染48 h后，与空白对照组(1.05±0.12)相比，miR-124模拟组中miR-124的相对表达量(5.18±0.35)显著升高(P<0.05)，而与阴性对照组(1.12±0.16)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3上调miR-124表达诱导SW579细胞凋亡 3组凋亡率差异有统计学意义(F=69.463，P=0.000)。与空白对照组(6.58%±1.32%)相比，miR-124模拟组中SW579细胞凋亡率(22.65%±2.36%)显著升高(P<0.05)，而阴性对照组(7.15%±1.86%)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4上调miR-124表达对PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax表达的影响 与空白对照组相比，miR-124模拟组中PIK3CA、p-AKT和Bcl-2蛋白表达量均显著降低，Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)，而AKT蛋白表达量变化不明显(P>0.05)；阴性对照组和空白对照组PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax蛋白表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 上调miR-124表达对PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax蛋白表达的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05

3 讨 论

miR-124是一个最初由RNA聚合酶Ⅱ转录而来的高度保守miRNA。人类成熟miRNA-124是由分别位于8p23.1染色体上的pre-miR-124-1、8q12.3染色体上的pre-miR-124-2和20q12.3染色体上的pre-miR-124-3剪切而来〔8，9〕。研究发现，miR-124在多数肿瘤中呈现低表达，与多种肿瘤的预后诊断和治疗密切相关，在肿瘤细胞的增殖、侵染、转移和凋亡等生理病理过程中发挥着重要作用〔10，11〕。Dong等〔10〕研究指出，miR-124在乳腺癌中表达下降与乳腺癌患者的预后不良有关。Zhang等〔11〕研究发现，miR-124在肺癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织，miR-124低表达组中肺癌患者5年内生存率明显缩短。有研究发现，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中干扰miR-124 表达后，细胞增殖和克隆形成明显受到抑制，细胞凋亡率显著升高〔12〕。恢复miR-124在胃癌细胞中的表达，能够通过靶向EZH2基因抑制胃癌细胞增殖和克隆形成，且与5-氟尿嘧啶联合抗胃癌效果更佳〔13〕。甲状腺癌的发生发展是一个复杂过程，与多种miRNAs的异常表达密切相关。近年来研究发现，miR-124在甲状腺癌组织中呈现低表达，且干扰miR-124表达，可通过调控STAT3基因的表达影响K1细胞的增殖和侵袭〔14〕。

细胞凋亡是生物体内重要的生命活动，在甲状腺癌发生发展、预后和产生耐药性过程中发挥重要作用。细胞凋亡是由多种基因和蛋白共同调控的结果，Bcl-2家族蛋白通过直接或间接作用于线粒体在细胞凋亡过程中发挥关键的调控作用。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax作为Bcl-2家族蛋白中的重要成员，在包括甲状腺癌等多种肿瘤组织中异常表达，与甲状腺癌细胞凋亡密切相关〔15，16〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路在炎症、肿瘤等疾病的发生发展过程中具有重要作用，通过上游分子与PI3K结合，磷酸化激活AKT，使PI3K/AKT信号通路活化参与肿瘤的调控。PI3K/AKT信号通路相关基因或分子异常表达所引起的功能获得或缺失与多种恶性肿瘤细胞的增殖和凋亡等生物学特性转变密切相关〔17〕。PIK3CA是PI3K/AKT信号通路中的关键分子，作为一种癌基因在多种肿瘤组织中异常表达，与肿瘤的诊断、治疗及预后密切相关〔18，19〕。有研究发现，miR-124能够通过激活PI3K/AKT信号通路在缺血性脑卒中发挥神经保护作用；过表达miR-124通过下调PIK3CA表达抑制肝癌HepG2细胞增殖；miR-124能够抑制甲状腺功能减退大鼠中海马神经元凋亡，其作用机制与下调Bax和上调Bcl-2的表达有关〔20～22〕。本研究结果提示，miR-124可能通过抑制PI3K/AKT信号通路活性，上调Bax和下调Bcl-2表达诱导甲状腺癌SW579细胞凋亡。

综上，miR-124在甲状腺癌的发生发展过程中发挥重要作用，过表达miR-124能够诱导甲状腺癌细胞凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路活性，上调Bax和下调Bcl-2表达有关。