补体应答基因32基因对心肌梗死心肌细胞凋亡及免疫机制的影响

张文昶 李远冠 黄 深 何 川

(北京航天中心医院心内科，北京 100049)

心肌梗死发病率、致残率和致死率均较高，心肌细胞缺血缺氧是心肌梗死过程中引起细胞发生不可逆转凋亡或死亡的主要原因，并可导致心功能不全〔1，2〕。细胞凋亡所引起的心肌细胞丢失在心肌梗死引起的心力衰竭中具有重要作用〔3〕。研究发现，生长因子、皮质激素、转化生长因子(TGF)-β、黄体生成素等多种因子均能诱导补体应答基因(RGC)32的表达，在肿瘤转移、增殖分化、炎症反应等过程中有关键作用，从而影响人类多种疾病的发生发展〔4，5〕。作为TGF-β1信号通路下游基因，过表达RGC32的人近端肾小管上皮细胞无TGF-β1刺激即可发生上皮细胞-间质转化(EMT)，而敲除RGC32的细胞中有TGF-β1刺激也不能发生EMT〔6〕，此外，有研究发现在纤维结缔组织形成过程中出现RGC32的表达上调〔7〕。但RGC32对心肌梗死心肌细胞的影响及机制尚未清楚。本研究旨在探讨RGC32基因对心肌梗死心肌细胞凋亡及免疫机制的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 12周龄C57BL/6雄性小鼠，25～30 g，用于心肌梗死模型的制备；SPF级出生1～3 d的SD大鼠乳鼠用于原代心肌细胞的获得，实验动物均购自中国医学科学院，均得到动物委员会批准。

1.2主要试剂和仪器 胎牛血清、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒和电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Piece；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Bcl-2相关X蛋白(Bax)、 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、Notch1、Hes1抗体均购自美国abcam公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3RGC32基因在心肌梗死心肌组织的表达 参照石洪涛等〔8〕的方法建模，小鼠经水合氯醛(3.3%)麻醉固定后，开胸结扎小鼠冠状动脉前降支，建立心肌梗死模型，心电图ST段检测发现有明显提高，且心尖部变白为模型建立成功。取心肌组织，提取组织中的总蛋白，BCA法对蛋白进行定量，取30 μg蛋白样品行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离，转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭后加入一抗，RGC32及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)均按照1∶1 000稀释，4℃过夜孵育后洗膜，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，洗膜，增强型ECL显影。

1.4心肌细胞转染及缺血缺氧模型的制备 无菌条件下剔出大鼠的心脏，除去大血管、心房等一些结缔组织，加入已经配置好的胰酶对心肌细胞进行消化。消化完全后收集组织消化悬液，离心，弃掉上清，含有10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，按照密度5×104/cm2接种细胞于培养板或培养瓶培养，细胞处于生长对数期后按照ABI公司的转染方法转染RGC32的siRNA于心肌细胞，转染12 h后，将培养液换为不含胎牛血清的DMEM培养基，将培养皿放置于培养罐内，并在缺氧罐中放Genbox厌氧产气包，制造成缺血缺氧模型，最后放置培养罐于37℃、5% CO2培养箱中培养，缺血缺氧处理48 h后收集细胞用于实验研究。实验分为正常对照组、阴性对照组(转染不具有干扰作用的siRNA并进行缺血缺氧处理)、缺血缺氧组、缺血缺氧+RGC32-siRNA组(转染干扰RGC32表达的siRNA并进行缺血缺氧处理)。

1.5TUNEL法检测各组细胞凋亡 各组细胞凋亡参照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的操作说明。

1.6各组白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达检测 通过RT-PCR检测各组细胞中炎症因子IL-6和TNF-α表达。通过Trizol法提取细胞中的总RNA，根据逆转录试剂盒操作反转录为cDNA，以cDNA为模板，20 μl反应体系，实时荧光定量PCR仪进行扩增，所有引物由上海生工合成。采用2-△△Ct比较法根据Ct均值对RGC32的mRNA相对含量进行定量。

1.7各组细胞RGC32、Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达检测 各组细胞中RGC32、Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白的表达参照1.3方法。

1.8统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1心肌梗死小鼠心肌组织RGC32的表达 RGC32在心肌梗死心肌组织中的表达(0.668±0.053)显著高于正常心肌组织(0.112±0.015，t=17.484，P=0.000)。

2.2RGC32在心肌细胞表达 阴性对照组(0.689±0.075)与缺血缺氧组RGC32(0.712±0.079)差异无统计学意义(t=0.466，P=0.654)，缺血缺氧组显著高于正常对照组(0.105±0.012)和缺血缺氧+RGC32-siRNA组(t=12.301，5.411；P=0.000，0.001)。

2.3RGC32对心肌细胞凋亡的影响 阴性对照组(27.16%±1.88%)和缺血缺氧组心肌细胞凋亡率(28.39%±2.03%)差异无统计学意义(t=0.975，P=0.358)，缺血缺氧组显著高于正常对照组(2.48%±0.56%)和缺血缺氧+RGC32-siRNA组(15.65%±1.26%；t=20.530，10.095，均P=0.000)。

2.4RGC32对心肌细胞IL-6和TNF-α表达的影响 阴性对照组和缺血缺氧组IL-6和TNF-α表达差异无统计学意义(t=0.673，0.695，P=0.520，0.507)，缺血缺氧组均显著高于正常对照组(t=9.213，24.031，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA组(t=4.726，7.992，P=0.002，0.000)。见表1。

表1 RGC32对心肌细胞IL-6和TNF-α表达的影响

与缺血缺氧组比较：1)P<0.05；下表同

2.5RGC32对心肌细胞Caspase3、Bax、Notch1、Hes1表达的影响 阴性对照组和缺血缺氧组Caspase3、Bax、Notch1、Hes1表达差异无统计学意义(t=0.312，0.579，0.406，0.380，P=0.763，0.579，0.695，0.714)，缺血缺氧组Caspase3和Bax表达均显著高于正常对照组(t=9.505，8.356，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA组(t=4.683，3.321，P=0.002，0.011)，Notch1和Hes1表达显著低于正常对照组(t=12.158，9.787，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA组(t=8.288，4.961，P=0.000，0.001)。见表2。

表2 RGC32对心肌细胞Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达的影响

3 讨 论

目前，心肌梗死已成为我国疾病引起死亡的原因之一，心肌细胞缺血缺氧引起的心肌细胞凋亡是导致心肌梗死后心力衰竭、心功能不全的一个关键因素〔9〕。RGC32在细胞的增殖、分化、再生及炎症反应中均发挥重要作用，在多种疾病中也备受关注〔10〕。有研究发现，在充血性心力衰竭患者进行左心室辅助支持装置植入，心肌结构发生重塑过程中RGC32表达升高，在小鼠心肌肥厚实验模型中也发现RGC32的表达升高〔11，12〕。

本研究结果发现缺血缺氧可引起心肌细胞凋亡，而抑制RGC32表达可减轻这一效应。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡方式，一方面可维持机体的正常生长发育，也参与多种疾病的发生。细胞凋亡过程中Caspase家族和Bcl-2家族起到关键作用，Caspase3是Caspase家族的关键酶，处在其级联反应下游，活化的Caspase3可使凋亡进入不可逆阶段〔13，14〕。研究发现，在心肌梗死中Caspase3被激活〔15〕。Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，活化的Bax可诱导线粒体释放细胞色素C，从而诱导细胞的凋亡〔16〕。本研究结果提示RGC32可通过下调Caspase3和Bax表达降低心肌梗死心肌细胞的凋亡。

心肌梗死后心功能不良及心室重构的一个关键因素是炎症损伤，心肌缺血缺氧而导致的无菌性炎症反应，可引起免疫细胞的聚集与活化，释放IL-6、TNF-α等一些炎症因子〔17，18〕。有研究发现，IL-6和TNF-α表达水平与慢性心力衰竭进展有密切关系，可导致左心室扩大和壁变薄、心室收缩功能减退〔19〕。Notch1信号通路是一条在进化上高度保守的信号转导途径，其家族成员对细胞的发育、凋亡、分化等过程有重要作用〔20〕。研究发现，激活Notch1信号通路可保护心肌细胞的缺氧复氧损伤，可加快心肌梗死后心功能的恢复〔21〕。Hes1基因是Notch1信号通路下游重要的效应分子，是其是否激活的标志。本研究发现RGC32可提高由缺血缺氧引起Notch1和Hes1表达的降低。

综上，RGC32基因在心肌梗死心肌组织表达升高，抑制心肌细胞RGC32基因表达可降低细胞凋亡、提高免疫及激活Notch1信号通路，其中对心肌细胞凋亡的影响是下调Caspase3和Bax表达，提示RGC32可能是心肌梗死新的治疗靶点。