菠萝酒中SO2天然替代物的筛选及其抗氧化机理的分析

张大为，张洁，闫佳，田永航，裴志胜

（海南热带海洋学院生命科学与生态学院，海南省海洋食品工程技术研究中心，海南三亚 572022）

果酒酿造过程中，SO2作为添加剂一直沿用至今，主要在酿造、存储等环节中起到抗菌和抗氧化两个作用[1～3]。在果酒中SO2主要抑制酪氨酸酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等引起的酶促褐变及非酶促褐变，保护了果酒中多酚等还原性物质，进而减少酒体的氧化程度[4～7]。另一个方面SO2能够抑制果酒中腐败菌（包括野生酵母、有害乳酸菌和醋酸菌）的生长，主要通过与腐败菌结构蛋白中的酶、辅酶、核酸等物质发生反应来起到防腐杀菌的作用[8]。

尽管SO2在果酒中能够起到抗菌和抗氧化作用，但据报道它也会给人类的健康造成影响。大量研究结果表明，SO2能引起诸多包括皮炎、荨麻疹、血管性水肿、腹泻、腹痛、支气管狭窄和过敏反应等能使动物出现胃部发生病变、硫胺素缺乏及生长缓慢等健康问题。人体尤其是敏感人群对过量SO2会出现过敏反应，超过1 mg的计量时，就会出现哮喘等问题，大约占总过敏人群的4～10%。鉴于此，国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）建立了包括葡萄酒在内的果酒中二氧化硫含量的最高限量，当超过10 mg/L的计量时就要表明具体含量，总残留量不能超过50 mg/L，我国对此也有明确的限制，酿造过程中最大使用量不能超过250 mg/L。故找到能够替代SO2的替代品和方法已成为果酒生产者和研究者的当务之急，已成为生产安全绿色果酒的关键问题之所在[9～13]。

找到能够替代SO2抗菌和抗氧化作用的物质将是行之有效的办法。中草药是中华民族的瑰宝，众多中草药都含有丰富的抗菌成分及抗氧化成分，所以以中草药为筛选源，从中找到在果酒中既起抗菌作用又起抗氧化作用中草药在理论上是可行的，从而使减少果酒加工和存储过程中SO2的用量。本研究选取多种中草药作为筛选源，以菠萝酒为例，考察其在酒中的抗菌和抗氧化作用，希望找到能够减少菠萝酒中SO2用量的抗菌剂和抗氧化剂，并对其抗氧化机理进行初步研究，为生产出不加SO2的天然果酒奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要设备

菠萝汁：购买市售新鲜的香水菠萝，制备梨汁，调整糖度为15 Brix，备用；中草药：购于中药店或采于野外；酿造菌株Saccharomyces cerevisiaeDJ02：保存于实验室。

主要试剂：福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；DPPH（2,2-Diphenyl-1-hydrazyl），Sigma公司；Tris（三羟基氨基甲烷，Tris-hydroxymethy aminomethane），上海山浦化工有限公司；邻苯三酚（焦性没食子酸，Pryrogallic acid），贵州遵义佳宏化工有限责任公司；亚硫酸等其他试剂均为分析纯，由华星试剂公司代购。

主要设备：SP-752（PC）型紫外可见风光光度计，上海光谱仪器有限公司；ZDJ-4A型自动电位滴定仪，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂。

1.2 试验方法及内容

1.2.1 中草药的选择

根据文献资料及前期研究工作，选择具有潜在高效抗氧化性能、抗菌性能的27种中草药为研究对象，作为筛选源。

1.2.2 中草药提取物的制备

每种样品称量2 g加入100 mL三角瓶中，加水20 mL，隔水蒸15 min，过滤分装，冷却，保存至4 ℃的冰箱，备用。

1.2.3 菠萝酒酿造工艺

图1 菠萝酒酿造工艺流程图Fig.1 Process flow chart of pineapple wine brewing

1.2.4 菠萝酒发酵

取100 mL菠萝汁至于150 mL发酵瓶中，加入定量中草药提取物，其中对照组加入3 mL亚硫酸。于27 ℃培养箱中发酵，前酵时间为8 d。

1.2.5 抗菌实验

采用紫外可见分光光度计SP-752（PC）在波长为570 nm条件下，定期测定各组菠萝酒的吸光度值，以添加SO2的样品为标准对照（即每次测定吸光度以添加SO2的样品作为零点）[7]。

1.2.6 中药提取物定量实验

选取抗菌效果最好的中药发酵到第5 d时，来确定提取物的最佳添加量。

1.2.7 菠萝酒中总酚含量的测定

采用福林酚法测定菠萝酒中总酚含量。具体操作如下：用移液管精确量取菠萝酒样品0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入30 mL蒸馏水，摇匀，再加入2.5 mL福林酚试剂和7.5 mL 20%的Na2CO3溶液，用蒸馏水定容并混匀，75 ℃水浴反应 10 min，冷却后于波长760 nm处测吸光度。以添加SO2的样品作为对照。建立标准曲线，具体操作为：准确称取0.1 mg/mL的没食子酸0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL于50 mL容量瓶中，各加30 mL水，后续按上述方法操作[14]。

1.2.8 酿造菌株对SO2替代物的适应性

通过上述筛选，将具有高效抗氧化和抗菌性能的中药提取物加入到菠萝酒中，考察酿造菌株对其适应性，从而找到最适合菠萝酒发酵的SO2替代物。

1.2.9 SO2替代物抗氧化机理的初步探讨

1.2.9.1 菠萝酒氧化还原电位的测定

采用ZDJ-4A型自动电位滴定仪配合恒温搅拌器测定[15]。

1.2.9.2 多酚相对聚合度的测定

（1）FD值的测定：FD试剂的配制：在150 mL蒸馏水中，加入20 g钨酸钠、4 g磷钼酸、10 mL磷酸，回流2 h，冷却，稀释至200 mL。于100 mL容量瓶中依次加入2 mL样品、2 mL FD试剂和4 mL 20%的碳酸钠溶液，混匀后定容，于室温下放置1 h后于760 nm处测定吸光度值。（2）V值的测定：于10 mL容量瓶中依次加入2 mL样品、3 mL 1%香草醛乙醇溶液和4 mL浓盐酸，混匀后定容，于室温下放置30 min后于500 nm处测定吸光度值[16]。

1.3 数据统计分析

所有数据均采用平均值（Mean）±标准差（SD）表示。采用Excel 2010对数据进行画图。

2 结果与分析

2.1 中草药抗菌实验结果

图2 中草药抗菌结果Fig.2 Antibacterial results of Chinese herbal medicine

27种中药经过测试发现，有7种在菠萝酒中具有良好的抗菌特性，如图2所示。从空白曲线可以看出，酒中微生物生长曲线符合单细胞生长规律，这与果酒中腐败菌主要是野生酵母、乳酸菌、醋酸菌的结论是一致的。图中7种中药与空白组相比，都具有抗菌的作用，从第1 d到第3 d的延滞期内菌量缓慢上升，第3 d到第4 d的对数生长期内呈缓慢上升的趋势，但是与空白组相比，上述速度显著降低。第5 d以后进入稳定期，较对空白组来说，进入稳定期延长1 d。说明这7种中药均具有较显著抑制杂菌的作用。从图2可以看出，添加酸枣仁之后，菠萝酒在整个发酵过程中的吸光度A570nm均在0.001～0.141之间，与添加SO2的菠萝酒最为接近，故酸枣仁的抗菌效果最好，地菜子次子，具有潜在替代菠萝酒中SO2抗菌作用的能力。

2.2 中草药提取物定量实验结果

图3 酸枣仁加量对抗菌结果的影响Fig.3 Effect of the amount of semen zizyphi spinosae on antibacterial results

在菠萝汁中加入抗菌效果最好的酸枣仁，在发酵第5 d后检测其抗菌性能。如图3所示，添加量从1.5 mL/100 mL～4 mL/100 mL，发酵酒液在570 nm波长下的吸光度呈先下降后上升的趋势。中药提取物在 2.5 mL/100 mL的加量时，吸光度最低，即含菌量最低，抗菌效果最好。

2.3 福林酚法测定菠萝酒中总酚含量的结果

2.3.1 标准曲线的建立

所得标准曲线如图4所示，由上数据可得到标准曲线所对应的方程如下：

式中：y-吸光度值；x-总酚含量（μg/mL）。

图4 总酚含量测定的标准曲线Fig.4 Standard curve of total polyphenol content determination

表1 没食子酸含量及对应吸光度值Table 1 Gallic acid content and the corresponding absorbance values

2.3.2 以中草药作为抗氧化剂的菠萝酒中总酚含量的测定结果

图5 菠萝酒中总多酚含量的变化曲线Fig.5 Change curve of the whole polyphenol content in the pineapple wine

从图5可以看出，菠萝酒在添加SO2、地菜子和酸枣仁之后，总多酚含量在发酵前3 d之内下降比较明显，其中地菜子在第4 d之前下降比较明显。随着发酵的进行，多酚含量趋于稳定。从图可以看出，菠萝酒在添加酸枣仁和地菜子后的多酚含量都与添加SO2的相接近，均具有替代SO2抗氧化作用的潜力。酸枣仁在菠萝酒中的抗氧化作用要强于地菜子，故本实验可以确定酸枣仁的抗氧化作用最强。

2.4 SO2替代物对酿造用菌种 Saccharomyces cerevisiae DJ02的影响

图6 SO2替代物对酿造菌种Saccharomyces cerevisiae DJ02的影响Fig.6 Effect of SO2 substitution on Saccharomyces cerevisiae DJ02

菠萝汁经过121 ℃、15 min灭菌冷却后分别加入地菜子和酸枣仁提取物，本实验为了确定地菜子和酸枣仁提取物对酿造用菌株Saccharomyces cerevisiaeDJ02的影响，以此来确定适合于菠萝酒酿造的替代物。以SO2和不加任何添加物来酒样作为对照组。如图6所示，酒样中添加SO2、酸枣仁和地菜子后，均对Saccharomyces cerevisiaeDJ02的生长具有抑制作用。空白组中第2 d酿造菌株开始生长，标志延滞期结束并开始进入对数生长期，从第7 d开始进入稳定期。与对照组相比添加SO2、酸枣仁和地菜子的三种酒样中，酿造菌株均在第2 d到第3 d之间开始生长，比空白组稍晚，随后生长进入对数生长期。在第 6 d之前加入SO2和酸枣仁的酒样中的酿造菌株生长与空白组相比没有被明显抑制，但其在加入地菜子中受到较明显的抑制作用。如图6所示，在发酵第7 d以后，菌株生长到达稳定期，与空白组相比，其生长均不同程度地受到SO2、酸枣仁和地菜子的影响，酸枣仁和地菜子对Saccharomyces cerevisiaeDJ02生长的影响比SO2都小，说明两者均适合于菠萝酒的发酵。但是，从整个发酵过程来看，地菜子的添加相对于酸枣仁来说延长了酿造菌株的延滞期，表明在发酵前期地菜子抑制作用比较明显。综合来看，酸枣仁更适合于菠萝酒的酿造过程。

2.5 酸枣仁在菠萝酒中的抗氧化机理分析

2.5.1 菠萝酒中氧化还原电位测定结果

图7 菠萝酒中氧化还原电位的测定结果Fig.7 Determination results of the oxidation-reduction potential(Eh) in pineapple wine

氧化还原电位可以间接地反应菠萝酒的氧化程度，氧化还原电位低，说明还原性较强，氧化性较弱。从图7可以看出，未加酸枣仁的空白组酒样，其氧化还原电位随着时间的延长呈上升的趋势，而菠萝酒中的多酚含量却呈逐渐降低的趋势，说明其氧化程度在加深。在添加了酸枣仁提取物以后，菠萝酒的氧化还原电位逐渐减低，说明其被氧化的程度较低。综上所述，酸枣仁提取物的添加可以降低菠萝酒的氧化还原电位，延缓多酚类物质的氧化。

2.5.2 菠萝酒中多酚聚合度的测定结果

果酒被氧化主要是非酶褐变，非酶褐变主要分为两步。第一步是酚类物质的氧化，尤其是具有邻羟基结构的多酚最容易被氧化。在氧气和铜铁等金属离子的参与下，邻羟基酚被氧化生成邻醌或半醌自由基，同时氧被还原为过氧化氢。这一步中生成的醌类物质很不稳定，它能够自发地与菠萝酒中的亲和物质相结合，生成二聚体或多聚体。醌酚二聚体通过分子结构重排，可以产生新的二酚二聚体，新生成的二酚二聚体或多聚体比之前未聚合的多酚更容易发生氧化反应，从而更容易引起酚类物质的氧化聚合，生成更多的过氧化氢。过氧化氢在金属离子的作用下，发生Fenton反应，生成羟自由基。羟自由基具有极强的氧化性，但由于它存在的时间极短、作用半径也比较小，故最容易与菠萝酒中浓度较高的乙醇发生反应，将其氧化为乙醛。乙醛可以与黄烷醇类化合物反应，生成黄烷醇二聚体或三聚体，进而生成更加复杂的多聚体，从而使菠萝酒的氧化程度加深。

图8 菠萝酒中多酚相对聚合度的测定结果Fig.8 Determination results of the relative polymerization of polyphenols in pineapple wine

从图8中可以发现，与未添加酸枣仁的菠萝酒相比，加入了酸枣仁提取物后，菠萝酒中多酚的相对聚合度有明显的降低，从而减少羟自由基的产生，进而抑制菠萝酒中多酚的氧化。

3 结论

酸枣仁和地菜子在菠萝酒发酵中具有较好的抗菌和抗氧化性能，其中酸枣仁的抗菌和抗氧化性能较强，具有替代 SO2的潜力。酸枣仁的最佳添加量为 2.5 mL/100 mL。酸枣仁应用于菠萝酒发酵中，其对酿造菌株Saccharomyces cerevisiaeDJ02的影响相对于地菜子和SO2较小。酸枣仁加入到菠萝酒中以后，菠萝酒的氧化还原电位降低，从而减少酒体氧化；菠萝酒加入酸枣仁以后，使得菠萝酒中的多酚聚合度降低，进而延缓了氧化速度。