生存素对淀粉样前体蛋白代谢的调节作用

蒋伟青，袁欣，刘晨，任潇，王永刚

（1.上海交通大学医学院附属仁济医院 神经内科，上海 200127；2.郑州大学第一附属医院 神经内科，河南 郑州 450052）

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）病理学特点表现为脑内淀粉样斑块和神经原纤维缠结[1]。淀粉样斑块由β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积所形成，而Aβ由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经过蛋白水解作用而产生，APP代谢异常会导致Aβ的产生和清除失衡而导致Aβ过度沉积[2-3]。凋亡参与许多神经退行性疾病如AD的神经元死亡过程[4]。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的重要成员之一，在抑制凋亡和调控细胞分裂中起重要作用[4]。本研究探讨survivin对APP代谢的调节作用。

1 材料和方法

1.1 材料 原代大鼠海马神经元、PC12细胞购自上海赛傲公司。survivin抗体、APP抗体及GAPDH内参抗体购自英国Abcam公司。细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光技术：细胞爬片用PBS浸洗后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗后，0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min，PBS浸洗后用山羊血清室温封闭30 min，4 ℃孵育一抗过夜，PBST浸洗后，室温避光孵育荧光二抗，PBST浸洗后，封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.2 质粒转染：转染前1 d，将细胞接种到6孔板。次日，吸尽培养基，用Opti-MEM培养基洗涤细胞2次。对于每孔细胞，用200 μL Opti-MEM培养基分别稀释空载体1 μg、HA-APP质粒1 μg、HAAPP质粒和GFP-survivin质粒[5]各1 μg，混匀放置10 min后将Lipofectamine 2000与质粒混合，混匀后室温放置25 min，加入到6孔板的细胞中推匀，将培养板放入37 ℃孵育，转染48 h后进行蛋白提取或凋亡染料染色。

1.2.3 Western blot：利用CockTail/RIPA（1∶100）裂解细胞提取总蛋白，测定蛋白浓度后定量加样进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜后用5% BSA于室温慢摇封闭2 h，TBST洗涤后，4 ℃摇孵育一抗（5% BSA稀释）过夜，TBST洗涤后，室温慢摇孵育HRP二抗（5%BSA稀释）2 h，TBST洗涤后进行压片显影。

1.2.4 流式细胞仪检测：凋亡染色利用细胞凋亡检测试剂盒，PI和Annexin V染色后进行流式细胞仪分析，利用CellQuest软件对结果进行分析、绘制散点图。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS21.0进行统计学分析。计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，3组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光染色结果 通过免疫荧光染色后，利用激光共聚焦显微镜观察，发现在体外原代培养的大鼠海马神经元内survivin与APP可以共存。这一结果提供了survivin在神经系统内调节APP代谢的形态学证据（见图1）。

图1 大鼠海马神经元survivin与APP免疫荧光染色结果（×63）

2.2 Western blot检测结果 将构建好的HA-APP质粒分别单转染或者与GFP-survivin质粒共转染具有神经元反应性的PC12细胞，转染48 h后，裂解细胞，通过Western blot检测APP在PC12细胞内的表达。结果显示，APP和survivin共转染组与APP单转染组比，APP表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。这表明survivin可以抑制APP在PC12细胞内的表达。

2.3 流式细胞仪检测结果 将APP单转染与APP和survivin共转染PC12细胞用凋亡染料PI和Annexin V染色后，经流式细胞仪检测发现，APP单转染后出现了大量的细胞凋亡，APP和survivin共转染后凋亡率明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图3。表明APP过量表达可以诱发细胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的细胞凋亡。

3 讨论

本研究发现，体外原代培养的大鼠海马神经元内survivin与APP可以共存，survivin可以抑制APP在PC12细胞内的表达，APP过量表达可以诱发细胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的细胞凋亡。

凋亡是许多神经退行性疾病中神经元死亡过程的重要参与因素[4]。虽然一些临床和亚临床的研究已经报道IAP的神经保护作用，但是它们的临床益处尚不清楚。Survivin在胚胎组织及有细胞增殖的组织均有表达[6-7]，且在炎症组织[8]、创伤性脑损伤[9-10]和肿瘤组织[11-13]中有过表达。通过操纵survivin来抑制凋亡和调控有丝分裂从而达到神经元的保护作用，因此可在神经修复和保护中得以利用。细胞实验已证明survivin基因（杆状病毒IAP重复序列）突变体对分化后神经细胞具有促进分裂和增殖的作用[14]，另有动物研究报道，在脑损伤后，survivin参与调节成年小鼠海马DG区神经前体细胞活性并抑制神经元凋亡或程序性死亡[15]。另外，已有不同survivin突变体用于肿瘤治疗的研究[16]，借鉴类似的方法，有助于开拓对神经退行性

疾病治疗的新思路。

图2 Survivin抑制APP在PC12细胞内的表达

图3 Survivin抑制APP诱导的PC12细胞凋亡

APP是APP家族蛋白成员之一，不同的酶促作用使其产生具有不同生理作用的衍生物。APP参与引起痴呆的最常见的退行性疾病，即AD的病理生理过程。另外，有报导发现唐氏综合征的患者中APP表达升高。因此，研究参与调控APP代谢的机制对相关疾病的治疗研究具有一定价值[17]。目前关于AD的病理生理解释包括胆碱能假说、Aβ假说、tau蛋白假说和免疫假说[18]。其中主流的Aβ假说认为，APP代谢异常会导致Aβ的产生和清除失衡而导致Aβ过度沉积[2-3]。目前临床上对于AD的治疗策略包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂[19]，对于AD治疗策略的研究方向主要以Aβ和tau蛋白为靶点[18，20]。虽然目前尚未有利用survivin达到AD治疗效果的报导，但是，最近的一项研究发现，予转基因AD小鼠亚硒酸钠饮食，可上调Wnt/β-catenin信号通路并反式激活包括survivin在内的基因表达，同时可减少APP磷酸化从而减少APP裂解和Aβ形成[21]，表明survivin在调节APP代谢中的潜在作用。本研究发现，survivin可以抑制APP在细胞内的表达，同时survivin可以抑制APP过表达所引起的细胞凋亡。本研究结果对未来suivivin参与AD治疗方面的研究提供了一定理论基础。

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