一个同时携带线粒体tRNAMet4435A＞G和YARS2 c.5750A＞C基因突变的原发性高血压家系的线粒体功能

任晓燕，陈亚茹，时雯雯，郑斌娇，薛凌，管敏鑫

（温州医科大学，浙江 温州 325035，1.检验医学院 生命科学学院；2.Attardi线粒体生物医学研究院）

高血压是一种常见的慢性疾病，分为原发性高血压和继发性高血压，其中原发性高血压原因不明，约占全部高血压的95%[1]，是一种由基因和环境等多种因素共同调控的疾病，遗传方式主要涉及4种：常染色体显性、常染色体隐性、性染色体连锁和线粒体遗传，线粒体基因突变已报道与原发性高血压相关[2-4]。但线粒体基因突变并不是疾病发生的唯一条件[5]，核修饰基因同样会参与线粒体基因突变导致的原发性高血压表型的表达[6]，线粒体的功能不仅仅由线粒体基因调控，同时还需要核基因的参与。如线粒体蛋白翻译过程中，OXPHOS受mtDNA和核基因双重编码，此外还有许多蛋白受核基因的编码，在细胞质合成后转运到线粒体发挥功能。同时，mtDNA的合成、复制以及编辑修饰过程等也由核基因编码，因此，mtDNA结构和功能的完整性与核基因存在密不可分的关系。本研究通过对原发性高血压患者进行临床资料及基因组测序筛查，以线粒体tRNA基因突变和核基因YARS2基因突变作为切入点，发现一个高外显率的原发性高血压家系携带线粒体tRNAMet（以下简写为m.）4435A＞G和YARS2c.5750A＞C突变，并通过生化功能实验研究其对线粒体功能的影响，探讨m.4435A＞G和YARS2c.5750A＞C突变与原发性高血压的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 对同时携带m.4435A＞G突变和YARS2c.5750G＞T突变的原发性高血压家系进行样本采集和临床资料的完善，同时筛选并采集与突变组单体型相同的正常对照组样本。将研究对象分为4组：正常对照组细胞株，单突变组细胞株仅携带m.4435A＞G突变，双突变杂合组细胞株同时携带m.4435A＞G突变和YARS2c.5750A＞C杂合突变，双突变纯合组细胞株同时携带m.4435A＞G突变和YARS2c.5750A＞C纯合突变。携带m.4435A＞G突变和YARS2c.5750A＞C突变的耳聋家系来自浙江省。携带YARS2c.5750A＞C单突变的样本来自江西省。正常对照样本来源于本课题组前期建立的正常样本资源数据库。参与本研究的患者家系及正常对照样本人群均已按照温州医科大学伦理委会管理规定的方法签署知情同意书，符合伦理学规范，严格遵守伦理学规定和要求。构建采集的突变样本及正常对照样本的永生化淋巴母细胞系，并利用基因测序等手段对转化细胞的成功性进行验证。细胞系构建成功后，我们分别检测细胞的线粒体tRNA稳态水平、细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成水平和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）的变化。从而探究与原发性高血压相关的m.4435A＞G突变和YARS2c.5750A＞C突变共同作用的分子致病机制。

1.2 方法

1.2.1 DNA序列的测定与分析：以提取的外周血全基因组DNA为模板，设计并合成线粒体24对引物（引物可完全覆盖整个线粒体基因组序列）以及YARS2基因5对外显子引物对已提取的样本DNA进行序列扩增，通过PCR扩增先证者、家系成员及对照组成员线粒体基因组序列，YARS2基因序列全部PCR产物纯化后，将产物送至杭州擎科生物科技有限公司进行DNA序列分析[7]。最后将反馈的测序峰图与剑桥标准序列修正版进行序列分析比对，利用分析软件Codoncode Aligner进行突变筛查。先证者及其母系成员的线粒体基因全序列分析结果显示，属于东亚线粒体单体型G2。tRNAMet4435位点在进化上高度保守，该位点对应tRNAMet二级结构反密码子环的37位，m.4435A＞G突变可能影响与D茎13位和额外环46位的相互作用，进而影响tRNAMet二级结构的形成及稳定性。

1.2.2 永生化淋巴母细胞系的建立：通过EB病毒转化建立人类永生化外周血类淋巴母细胞系，其原理为EB病毒感染并与人外周血B淋巴细胞膜上的EB病毒受体结合后转化细胞，产生可在体外长期传代生长的淋巴母细胞系，表现出永生化的特征，使在体外研究细胞功能和分子遗传机制变为可能[8]，成为研究线粒体突变的最有效的工具。本研究建立的细胞系包括2个健康对照组和3个患者家系成员。

1.2.3 ROS检测：利用美国Sigma公司ROS检测试剂盒，通过流式细胞术分别检测正常状态及H2O2刺激后氧化应激状态下，突变型和野生型细胞株的ROS产量，对细胞内的ROS水平进行检测评估[9-10]，通过对刺激前后荧光强度相对值的比较分析，即可反映出线粒体ROS水平[11-13]。

1.2.4 MMP检测：使用美国Abcam公司MMP检测试剂盒（JC-10）对细胞进行荧光染色，通过流式细胞术间接衡量线粒体膜电位水平。

1.2.5 tRNA稳态水平检测：为进一步检测m.4435A＞G突变以及YARS2c.5750A＞C突变对tRNAMet稳态水平的影响，分别提取各样本的线粒体RNA，并分别与地高辛标记的线粒体tRNAMet、tRNATyr、tRNAGln、tRNAArg、tRNAHis和细胞的核基因编码的5S RNA探针进行Northern blot杂交实验。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 家系分析和临床评估 图1所示为家系图。此家系共3代26名，母系成员15名，其中7名患原发性高血压，患病率为46.6%，患者平均收缩压为（150±5）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），平均舒张压为（89±10）mmHg；非母系成员无发病者。对家系患病成员进行血常规、血生化检查和病史调查，均无其他临床综合征表现，排除继发性高血压的可能。

图1 携带线粒体m.4435A＞G和YARS2 c.5750A＞C突变的原发性高血压家系图

2.2 线粒体基因和YARS2基因测序分析 对家系所有成员线粒体及YARS2基因进行扩增和测序分析，并将测序结果与人类线粒体DNA标准剑桥序列（Genbank NC_012920）和YARS2基因标准序列（RefSeq NC_000012.12）对比分析，本次采集的母系成员的线粒体基因均携带m.4435A＞G突变（见图2A），同时mtDNA序列还存在多种无功能意义的多态性位点；YARS2基因c.5750位点存在不同程度突变（见图2B）。图3所示为突变所在位置，4435突变位点位于线粒体tRNAMet反密码子的第37位，在17个物种中的保守性为100%，其突变可能破坏线粒体tRNA的结构和功能。

图2 m.4435A＞G及YARS2 c.5750A＞C突变的鉴定

2.3 突变对线粒体tRNA稳态水平的影响 m.4435A＞G突变破坏了tRNAMet5’接受臂上高度保守的A-U配对，可能影响tRNA的结构和功能；核基因YARS2编码线粒体酪氨酸-tRNA合成酶，在细胞质中合成后转运至线粒体，催化酪氨酸与相应tRNA发生酯化反应形成氨酰tRNA的酶，参与线粒体翻译过程。为进一步检测m.4435A＞G突变对tRNAMet稳态水平以及YARS2c.5750A＞C突变是否对线粒体突变具有加重作用，研究中每种突变各选取1个样本，正常对照组选用2个样本（CL1-2、C072为正常对照；NT719-P3仅携带m.4435A＞G突变；NT719-P2同时携带YARS2c.5750A＞C杂合及m.4435A＞G突变；NT719同时携带YARS2c.5750A＞C纯合及m.4435A＞G突变），分别提取各样本的线粒体RNA，并分别与地高辛标记的线粒体tRNAMet、tRNATyr、tRNAGln、tRNAArg、tRNAHis和细胞的核基因编码的5S RNA探针进行了Northern blot杂交实验，结果如图4A所示，携带m.4435A＞G突变的样本（NT719-P2、NT719-P3和NT719）tRNAMet稳态水平明显低于未突变样本，分别为对照样本的91.53%（P=0.1945）、61.08%（P=0.1152）和43.34%（P=0.0012）；携带YARS2c.5750A＞C突变的样本（NT719-P2和NT719）tRNATyr稳态水平亦明显低于未突变样本，分别为对照样本的74.29%和72.1%；其他线粒体tRNAGln、tRNAArg、tRNAHis的稳态水平差异均无统计学意义，见图4B。2.4 突变对细胞ROS水平的影响 如图5所示，与对照组比，所有母系成员的细胞株ROS水平均出现较大幅度的升高：m.4435A＞G单突变样本（NT719-P3）、双突变杂合组（NT719-P2）和双突变纯合组（NT719）分别是对照组的137.41%（P=0.0028）、127.84%（P=0.0434）、155.76%（P=0.0025）。

图3 突变所在位置

图4 Northern blot杂交实验结果

2.5 突变对MMP水平的影响 用JC-10荧光探针检测突变型与野生型的MMP变化。MMP的变化是由EX/Em=490/590和Ex/Em=490/530的平均荧光强度比值反应，即FL590/FL530表示MMP水平。结果如图6A所示：m.4435A＞G单突变样本（NT719-P3）、双突变杂合组（NT719-P2）和双突变纯合组（NT719）分别是对照组的78.96%（P=0.0096）、67.95%（P=0.0030）和59.13%（P=0.0017）。而经解偶联剂CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）处理后，细胞膜对H+通透性大大提高，使膜两侧的质子梯度消除，从而野生型和突变型细胞间的MMP没有显著差异，见图6B。提示携带线粒体m.tRNAMet4435A＞G和突变影响线粒体去极化，导致MMP降低。

图5 细胞ROS水平分析

图6 MMP分析

3 讨论

外周血淋巴细胞在体外寿命有限，而人类永生化淋巴母细胞系具有可以在体外进行无限繁殖和生存的特性[14]，因此可以使人类珍贵的原发性高血压家系遗传资料得以永久保存[15]。本研究采用的方法为构建各个突变细胞株以及野生型细胞株的永生化淋巴母细胞系，然后通过一系列研究比较野生型细胞系和携带m.4435A＞G突变和YARS2c.5750A＞C突变细胞功能上的差异，从而研究m.4435A＞G突变和YARS2c.5750A＞C突变与原发性高血压的相关性。

m.4435A＞G突变是一个已经报道的可能与母系遗传原发性高血压相关的一个位点，该突变破坏了tRNAMet反密码子环上高度保守的A-U配对，可能影响tRNA的结构和功能[16]，引起线粒体整体翻译水平下降，造成氧化磷酸化水平降低；核修饰基因YARS2c.5750A＞C突变是在中国母系遗传性耳聋家系中发现的首个核修饰基因，核基因YARS2编码线粒体酪氨酸-tRNA合成酶，在细胞质中合成后转运至线粒体，催化酪氨酸与相应tRNA发生酯化反应形成氨酰tRNA的酶，参与线粒体翻译过程[17]，由此推测YARS2c.c.5750A＞C突变加重m.4435A＞G家系原发性高血压表型的表达。

曾有报道显示核基因突变与线粒体基因突变同时存在会导致某些疾病的发生。GUAN等[5]于2006年首次报道核修饰基因TRMU 28A＞G纯合突变与mtDNA1555A＞G纯合突变同时存在时，会导致非综合征性耳聋的发生，第一次将核基因与线粒体疾病联系起来。同时Leigh综合征中发现核基因和线粒体基因都存在突变，其中包括核基因的SURF1、PDHC等突变，这些基因都与线粒体呼吸链复合体活性相关[18]。线粒体上的突变有：8993T＞G/C。而且mtDNA的合成、复制、修饰加工等过程以及与酶复合体组装有关，许多蛋白质的完整性受到核基因和mtDNA的双重调控作用[19]。

本研究tRNA稳态水平结果显示，携带m.4435A＞G突变的样本的tRNAMet稳态水平明显降低，且双突变纯合样本的tRNAMet降低量要多于双突变杂合样本，该结果提示YARS2c.5750A＞C突变可能对m.4435A＞G突变导致的tRNAMet代谢异常具有加重作用。线粒体tRNA水平的异常会导致呼吸损伤，最终表现为细胞某些功能的异常，本研究结果表明携带m.4435A＞G单突变样本的MMP降低量为21.04%，而双突变样本的MMP下降量为32.05%～40.87%。正常的MMP水平是维持线粒体进行氧化磷酸化的必要条件，MMP的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件[20-21]，将会导致突变样本的线粒体质子电化学势的下降，进而导致更多的电子从电子传递链中泄露，由此引起ROS产量增加。本研究中m.4435A＞G单突变样本ROS升高量为27.84%，而双突变样本的ROS升高量为37.41%～55.76%，提示YARS2c.5750A＞C突变对m.4435A＞G突变引起的ROS升高有加重的作用，进一步明确了tRNAMet代谢异常在细胞呼吸缺陷产生的过程中发挥了重要作用。

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