儿童急性白血病骨髓单个核细胞中TAp63基因的表达及意义研究

潘阳琼，陈豪，宋春兰，成怡冰*

p63基因作为p53家族成员之一，定位于3号染色体长臂2区7带（3q27～3q29），分布于皮肤、肌肉、乳腺、食管、肺、脾、淋巴细胞、神经组织、消化系统及泌尿生殖系统。p63基因的表达受两种不同启动子的调节而产生两种具有不同活性的蛋白质，一种是全长链的活化型p63（TAp63），另一种是显性失活的截短型p63（ΔNp63）［1］。潘阳琼等［2］研究显示，TAp63基因在成年人血液系统恶性肿瘤中表达增高，而这与TAp63基因在实体肿瘤中作用不同有关。为探索TAp63基因在儿童急性白血病发生、发展中的作用及其临床意义，本研究采用半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，对儿童急性白血病初发、复发、化疗后达完全缓解的患儿以及对照组骨髓单个核细胞中TAp63基因的表达进行了检测。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2015年6月—2016年6月郑州大学第三附属医院和郑州儿童医院儿科住院的初治或复发急性白血病患儿104例为急性白血病组，患儿均符合儿童急性白血病的诊断标准［3］，其中男64例，女40例；年龄1～12岁，中位年龄7岁；急性淋巴细胞白血病（ALL）80例〔急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）61例，急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）19例〕，急性非淋巴细胞白血病（ANLL）24例；初发患儿90例（高危型18例、低危型72例），复发患儿14例（均为高危型）。同期选择郑州大学第三附属医院和郑州儿童医院住院的非恶性血液病患儿36例作为对照组，其中男24例，女12例；年龄2～13岁，中位年龄8岁；包括传染性单核细胞增多症16例、免疫性血小板减少症14例、缺铁性贫血6例。

1.2 TAp63 mRNA检测 所有患儿化疗前采集骨髓标本2～4 ml，置于肝素抗凝管中，用Ficoll液分离骨髓单个核细胞，采用美国Gibco公司的TRIzol试剂盒，利用一步法提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书步骤进行，该试剂盒及说明书由北京康为世纪生物科技有限公司提供，反应体系20 μl，包括 5×RT Mix 4 μl，PrimerMix 2 μl，RNA Template 5 μl，HiFi-MMLV Mix 1 μl，RNase-free water 8 μl，37 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min后终止反应。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，TAp63上游引物5'-GGGTGAGCGTGTTATTGATG-3'，下 游 引 物5'-TTAGATGCCAGGTCAGATGTT-3'，扩增片段314 bp；内参照β-actin上游引物5'-TGAAGTGTGACGTGGACATCCG-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCCAG-3'， 扩 增 片 段449 bp。反应体系25 μl，包括cDNA 4 μl，上下游引物各 1 μl，2×Taq MasterMix 12.5 μl，其余以 RNasefree water补足至 25 μl，引物终浓度为 0.4 μmol/L。2×Taq MasterMix由北京康为世纪生物科技有限公司提供，PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃终延伸5 min。取PCR扩增产物5 μl上样于2%琼脂糖凝胶中电泳后观察结果，以Gene tools from SynGene软件进行扫描并测定其灰度值，以TAp63与β-actin PCR产物条带灰度值的比值代表TAp63 mRNA相对表达量。TAp63 mRNA相对表达量＞0即为TAp63基因阳性表达。

1.3 治疗方案 根据张之南等［3］主编的《血液病诊断及疗效标准》（第3版）对所有急性白血病患儿行骨髓穿刺做骨髓形态学及细胞遗传学检查，根据检查结果，将所有患儿分为低危型、中危型、高危型，其危险度分型标准相同。化疗方案即诱导缓解方案：ALL患儿采用推荐儿童癌症和白血病组（CCLG）-ALL 2008方案［4］，即VDLP方案（长春新碱、柔红霉素、门冬酰胺酶、泼尼松）；ANLL患儿采用推荐方案［4］，低危型和中危型（除急性早幼粒细胞性白血病）：选DAE方案（柔红霉素、阿糖胞苷、依托泊苷）；高危型：选IA方案（去甲柔红霉素、阿糖胞苷）。临床疗效按照张之南等［3］主编的《血液病诊断及疗效标准》（第3版）判定。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理，计数资料比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法；计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAp63基因在急性白血病组及对照组患儿中的表达 急性白血病组104例患儿中TAp63基因阳性表达86例，阳性表达率为82.7%，TAp63 mRNA相对表达量为（0.61±0.19）；对照组患儿TAp63基因阳性表达0例。

2.2 TAp63基因在ALL与ANLL患儿中的表达 ALL与ANLL患儿TAp63基因阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；ALL患儿TAp63 mRNA相对表达量较ANLL患儿升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.3 TAp63基因在初发与复发患儿中的表达 初发与复发患儿TAp63基因阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；复发患儿TAp63 mRNA相对表达量较初发患儿升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.4 TAp63基因在B-ALL与T-ALL患儿中的表达B-ALL患儿TAp63基因阳性表达率、TAp63 mRNA相对表达量较T-ALL患儿升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.5 TAp63基因在高危型与低危型初发患儿中的表达

高危型与低危型初发患儿TAp63基因阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高危型初发患儿TAp63 mRNA相对表达量较低危型初发患儿升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

2.6 TAp63基因在完全缓解与未缓解患儿中的表达急性白血病组患儿中58例进行了系统治疗，包括初发急性白血病患儿40例，复发急性白血病患儿18例。初发40例急性白血病患儿中，经诱导化疗后达完全缓解30例（75.0%），未缓解10例（25.0%）；18例复发急性白血病患儿中达完全缓解6例，未缓解12例。完全缓解与未缓解患儿TAp63基因阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；未缓解患儿TAp63 mRNA相对表达量较完全缓解患儿升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表5）。

3 讨论

人类p63基因定位于染色体3q27～3q29，在两个不同的启动子控制下，编码两类转录产物：一类为TAp63，另一类为ΔNp63，二者亚型结构不同，作用也不同，本研究探讨的是具有转录激活区的TAp63，所设计的引物为TAp63α、TAp63β和TAp63γ共有的中间序列，以保证RT-PCR产物的特异性，使RT-PCR扩增产物为具有转录活性的TAp63，以与ΔNp63区别开。

表1 ALL与ANLL患儿TAp63基因阳性表达率及TAp63 mRNA相对表达量比较Table 1 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between ALL and ANLL children

表2 初发与复发患儿TAp63基因阳性表达率及TAp63 mRNA相对表达量比较Table 2 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between incipient and recurrent children

表3 B-ALL与T-ALL患儿TAp63基因阳性表达率及TAp63 mRNA相对表达量比较Table 3 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between B-ALL and T-ALL children

表4 高危型与低危型初发患儿TAp63基因阳性表达率及TAp63 mRNA相对表达量比较Table 4 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between high-risk and low-risk incipient children

现阶段TAp63基因在肿瘤发生、发展中的作用尚不明确，相关研究发现可能有以下机制：（1）TAp63基因可影响细胞因子的水平，从而影响骨髓造血微环境，骨髓造血微环境的改变会影响肿瘤细胞的生存，如BINSKY等［5］发现在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中通过自然配体刺激CD74从而上调TAp63基因的表达，TAp63基因表达水平升高可使得整合素极迟反应抗原（VLA-4）的表达水平升高，从而促进白血病细胞归巢到骨髓，减少白血病细胞的凋亡，白血病细胞凋亡减少，又会促进白血病的发生。GRAZIANO等［6］研究提示TAp63基因在造血及淋巴系统恶性肿瘤中高表达，而在实体瘤低表达。ORZOL等［1］同样认为TAp63基因在血液系统恶性肿瘤中高表达。HUMPHRIES等［7］研究表明TAp63基因在慢性粒细胞白血病（CML）及B细胞淋巴瘤中均高表达。TAp63基因同样在滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）中高表达［8-11］。（2）研究发现在甲状腺癌的发病机制中，TAp63基因可占据DNA中p53应答元件的结合位点，从而阻止具有更多转录活性的p53基因家族成员与其结合，提示在甲状腺癌中TAp63基因通过抑制p53家族基因的功能而起到致癌基因的作用［12］。

急性白血病作为儿童恶性肿瘤，发病率较高，病死率更是占儿童恶性肿瘤的第一位，其发病机制复杂。LANTER等［13］研究发现：CD74激活核因子（NK）-κB家族，上调TAp63基因表达，其通过上调Bcl-2 mRNA进而上调Bcl-2蛋白质的表达，最终达到抗凋亡的作用，同时LANTER等［13］指出CD74/NK-κB/TAp63是一种细胞抗凋亡途径。BINSKY等［5］发现：TAp63基因通过上调VLA-4基因的表达，同时与CD74共同抑制CLL细胞凋亡，并且促进其转移至骨髓中，为白血病细胞提供生存环境。

本研究中急性白血病组患儿TAp63基因阳性表达率为82.7%，TAp63 mRNA相对表达量为（0.61±0.19）；对照组患儿TAp63基因阳性表达0例，提示TAp63基因可能在细胞生长周期中起到抑制凋亡作用，延长了肿瘤细胞的生存时间，使肿瘤细胞恶性增殖，儿童急性白血病的发生可能与TAp63基因的高表达有关。本研究显示TAp63基因在ALL及ANLL患儿均有表达，同时ALL患儿TAp63 mRNA相对表达量较ANLL患儿升高，这与本课题组既往研究结果［2］一致。同时，本研究结果证明TAp63基因阳性表达率、TAp63 mRNA相对表达量尤其在B-ALL患儿中高表达，可能影响正常细胞的增殖及凋亡，并且参与了恶性肿瘤的发生、发展，这进一步提示TAp63基因在血液系统恶性肿瘤的发生与发展中扮演着致癌基因的角色，而不是抑癌基因的角色。

本研究结果显示，复发患儿TAp63 mRNA相对表达量较初发患儿升高，高危型初发患儿TAp63 mRNA相对表达量较低危型初发患儿升高，说明TAp63 mRNA高表达是儿童急性白血病复发的高危因素。未缓解患儿TAp63 mRNA相对表达量较完全缓解患儿升高，同时经推荐化疗方案治疗后，复发患儿效果欠佳，缓解率低。TAp63 mRNA相对表达量高的患儿化疗疗效更差，在临床治疗前如果对急性白血病患儿进行TAp63 mRNA表达水平检测，可能对其化疗疗效有一定的预测作用。TAp63基因的表达还与肿瘤的分化程度及预后相关。FUKUSHIMA等［14］发现，在FL中，TAp63基因阳性表达率随着病理分级的增加而增加。左学兰等［15］研究发现，在B细胞淋巴瘤中TAp63基因与凋亡指数（AI）和增殖指数（PI）呈正相关。

总之，TAp63基因可能通过促进增殖、抑制凋亡等途径参与儿童急性白血病尤其是儿童B-ALL的发生、发展，并与预后相关。目前已经有一些促进凋亡及抑制细胞增殖的靶向治疗药物在临床应用，对于儿童急性白血病的控制有一定疗效，本研究旨在为儿童急性白血病的治疗提供新的、更多的基因治疗靶点，TAp63基因就可能作为儿童急性白血病新的治疗靶点之一。

作者贡献：潘阳琼、陈豪进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，数据收集、整理，统计学处理，结果的分析与解释，撰写论文，进行论文的修订；宋春兰负责文章的质量控制及审校；成怡冰对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

［1］ORZOL P，HOLCAKOVA J，NEKULOVA M，et al.The diverse oncogenic and tumour suppressor roles of p63 and p73 in cancer：a review by cancer site［J］.Histol Histopathol，2015，30（5）：503-521.DOI：10.14670/HH-30.503.

［2］潘阳琼，刘延方，孙慧，等.急性淋巴细胞白血病患者骨髓单个核细胞TAp63基因的表达［J］.中国组织工程研究与临床康 复，2011，15（6）：1075-1078.DOI：10.3969/j.issn.1673-8225.2011.06.027.PAN Y Q，LIU Y F，SUN H，et al.TAp63 gene expression in bone marrow mononuclear cells derived from acute lymphoblastic leukemia patients［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，15（6）：1075-1078.DOI：10.3969/j.issn.1673-8225.2011.06.027.

［3］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.3版.北京：科学出版社，2007：131-132.ZHANG Z N，SHEN T.Diagnostic and therapeutic criteria of hematopathy［M］.3rd ed.Beijing：Science Press，2007：131-132.

［4］中华医学会儿科学分会血液学组，《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）［J］.中 华 儿 科 杂 志，2014，52（9）：641-644.DOI：10.3760/ema.j.issn.0578-1310.2014.09.001.The Hematology Group of the Chinese Medical Association，Editorial Board of the Journal of Pediatrics.Children with acute lymphoblastic leukemia treatment advice（fourth amendment）［J］.Chinese Journal of pediatrics，2014，52（9）：641-644.DOI：10.3760/ema.j.issn.0578-1310.2014.09.001.

［5］BINSKY I，LANTNER F，GRABOVSKY V，et al.TAp63 regulates VLA-4 expression and chronic lymphocytic leukemia cell migration to the bone marrow in a CD74-dependent manner［J］.J Immunol，2010，184（9）：4761-4769.DOI：10.4049/jimmunol.0904149.

［6］GRAZIANO V，DE LAURENZI V.Role of p63 in cancer development［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1816（1）：57-66.DOI：10.1016/j.bbcan.2011.04.002.

［7］HUMPHRIES L A，GODBERSEN J C，DANILOVA O V，et al.Pro-apoptotic TP53 homolog TAp63 is repressed via epigenetic silencing and B-cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia［J］.Br J Haematol，2013，163（5）：590-602.DOI：10.1111/bjh.12580.

［8］PRUNERI G，FABRIS S，DELL'ORTO P，et al.The transactivating isoforms of p63 are overexpressed in high-grade follicular lymphomas independent of the occurrence of p63 gene amplification［J］.J Pathol，2005，206（3）：337-345.DOI：10.1002/path.1787.

［9］CHILOSI M，ZAMO A，BRIGHENTI A，et al.Constitutive expression of DeltaN-p63alpha isoform in human thymus and thymic epithelial tumours［J］.Virchows Arch，2003，443（2）：175-183.DOI：10.1007/s00428-003-0857-4.

［10］NYLANDER K，VOJTESEK B，NENUTIL R，et al.Differential expression of p63 isoforms in normal tissues and neoplastic cells［J］.J Pathol，2002，198（4）：417-427.DOI：10.1002/path.1231.

［11］ALISI A，GIANNINI C，SPAZIANI A，et al.Hepatitis C virus core protein enhances B lymphocyte proliferation［J］.Dig Liver Dis，2007，39（Suppl 1）：S72-75.DOI：10.1016/S1590-8658（07）80015-6.

［12］MALAGUA RNERA R，MANDARINO A，MAZZON E，et al.The p53-homologue p63 may promote thyroid cancer progression［J］.Endocr Relat Cancer，2005，12（4）：953-971.DOI：10.1677/erc.1.00968.

［13］LANTER F，STARLETS D，GORE Y，et al.CD74 induces TAp63 expression leading to B-cell survival［J］.Blood，2007，110（13）：4303-4311.DOI：10.1182/blood-2007-04-087486.［14］FUKUSHIMA N，SATOH T，SUEOKA N，et al.Clinicopathological characteristics of p63 expression in B-cell lymphoma［J］.Cancer Sci，2006，97（10）：1050-1055.DOI：10.1111/j.1349-7006.2006.00284.x.

［15］左学兰，周颖，周新，等.存活蛋白和P63蛋白在B细胞非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及其对细胞凋亡和增殖的作用［J］.中 国 实 验 血 液 学 杂 志，2007，15（1）：99-102.DOI：10.3969/j.issn.1009-2137.2007.01.023.ZUO X L，ZHOU Y，ZHOU X，et al.Expression of survivin and p63 protein in B cell non-Hodgkin's lymphoma and their effects on cell apoptosis and proliferation［J］.Journal of Experimental Hematology，2007，15（1）：99-102.DOI：10.3969/j.issn.1009-2137.2007.01.023.