狼疮小鼠模型中ZBTB20、Blimp1的表达变化及其意义

朱 峰 裴 露 王婷婷 胡文坛 刘红春

(郑州大学第一附属医院检验科，河南 郑州 450000)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种病变累及肾脏、皮肤、肺脏等多器官的慢性自身免疫性疾病，主要以B细胞的多克隆增殖产生过量自身免疫球蛋白为特点，病情缓解和活动交替出现。锌指蛋白ZBTB20、Blimp1参与调控免疫细胞的增殖、分化、调节长寿命浆细胞增殖并促进免疫球蛋白的分泌〔1〕。本研究采用免疫组化和荧光定量PCR技术对两种狼疮小鼠模型和正常对照小鼠模型中ZBTB20 、Blimp1的表达情况进行试验分析，探究ZBTB20、 Blimp1的表达变化及其意义。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 MRL/lpr狼疮小鼠(12 w、25 w)、NZB/WF1狼疮小鼠(12 w、25 w)各10只为试验组，均购南京军区动物试验中心，雌性C57BL/6正常小鼠10只(12 w、25 w)为对照组，购自维通利华实验动物技术有限公司。鼠抗ds-DNA抗体酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、鼠免疫球蛋白(Ig)G ELISA试剂盒均购自上海生工生物公司，兔抗鼠ZBTB20抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，山羊抗兔IgG抗体购自中衫金桥生物技术有限公司，组织RNA提取试剂盒、RT反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒均购自takara公司。

1.2ELISA 分别取试验组、对照组共30只小鼠适量血清，加样、加标记抗体、洗板、加入标记的辣根过氧化物酶、洗板、显色、终止反应、多功能酶标仪检测450 nm波长值，得出抗双链DNA抗体、IgG的含量。

1.3免疫组化法(IHC) 30只小鼠分别取材后，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片、组织脱水、切片二甲苯脱蜡、抗原修复，标志物为ZBTB20，滴加一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗、二氨基联苯胺(DAB)室温显色，用光学显微镜观察染色结果。从试验组和对照组小鼠的脾脏、胸腺和淋巴结任取3个高倍镜视野，计数100个细胞中阳性细胞占的比例来计算阳性率，ZBTB20阳性细胞呈现棕褐色，阴性细胞呈现蓝紫色。

1.4实时荧光定量PCR(RT-PCR) 提取总RNA研磨各组织。按照说明书使用Trizol法提取各样品总RNA。提取完毕后制备琼脂糖凝胶，对样本进行琼脂糖凝胶电泳，分析比较5S 、18S及28S处条带，使用微量分光光度仪测定核酸浓度及纯度，将电泳条带清晰完整、并且OD260/280在1.8～2.1的样本用于后续的逆转录试验，剩余样品于-80℃备存。逆转录反应取cDNA 试剂盒，室温放置解冻后离心，于每个反应管中加入5×gDNA Eraser缓冲液2.0 μl、gDNA Eraser 1.0 μl、加入适量的样本并保证每个反应管中总RNA含量小于1 μg、加入RNase Free dH2O使得总体积达到10 μl，混匀后于42℃反应2 min，以去除DNA。然后向上一步的反应管中加入RNase Free dH2O 4.0 μl、5×PrimeScript缓冲液(for Real Time)4.0 μl、Prime Script RT Enzyme MixⅠ1.0 μl、RT Prime Mix 1.0 μl，混匀后于37℃反应15 min，85℃反应5 s，cDNA制备完成后放于-20℃暂存。

PCR引物设计与检验：从NCBI的GenBank网页中搜索鼠ZBTB20、Blimp-1全长序列基因，使用GAPDH为内参基因。设计引物模板后，在BLAST中查询比较，选择最优引物并由上海生工公司合成，合成的引物如下：鼠ZBTB20序列：正义链：5′-CAGCCAAACAG-ACTACGTCA-3′，反义链:5′-GCATCACCATGTGCTT GATA-3′；鼠Blimp1序列：正义链：5′-TTCTTGTGTGGTATTGTCGGGACTT-3′，反义链：5′-TTGGGGACACTC-TTTGGGTAGAGTT-3′ ；鼠GAPDH参照序列：正义链：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，反义链：5′-CTCGC-TCCTGGAAGATGGTG-3′。

RT-PCR反应：取PCR试剂盒解冻离心，向每个反应管中加入UltraSYBR混合物(2倍ROX)10 μl、前向引物(10 μmol/L)反向引物(10 μmol/L)各1.0 μl、RNase Free dH2O 6 μl、上述合成的模板cDNA 2 μl，短暂离心，之后放入荧光定量PCR仪中进行扩增，反应条件为95℃预变性10 min，1个循环；变性95℃15 s，60℃退火延伸1 min，重复40个循环；65℃至95℃绘制溶解曲线，使用2-△△Ct法计算所测基因相对表达量。

1.5统计学处理 应用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1两组血清相关抗体检测对比 培养至发病严重期的试验组小鼠脾脏明显的肿大，腹部淋巴结及胸腺等免疫器官或组织都有不同程度的肿大，抗dsDNA抗体和IgG 在试验组血清中的含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，说明构建的狼疮小鼠符合试验要求，见表1。

表1 小鼠血清免疫学指标比较

与对照组比较：1)P<0.01；下表同

2.2两组脾脏、胸腺和淋巴结免疫组化对比 试验组脾脏中，MRL/lpr小鼠阳性率22.4%，而NZB/WF1小

鼠阳性率41.5%。试验组的阳性表达率明显高于对照组(5.2%，P<0.05)，且NZB/WF1小鼠脾脏中ZBTB20阳性表达率显著高于MRL/lpr小鼠(P<0.05)。淋巴结及胸腺中MRL/lpr小鼠ZBTB20阳性表达率(13.4%、16.5%)、NZB/WF1小鼠(11.7%、15.2%)与对照组(10.2%、14.7%)比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

2.3两组脾脏、胸腺和淋巴结ZBTB20、Blim1 mRNA相对表达量对比 淋巴结、胸腺中试验组和对照组结果差异无统计学意义(P>0.05)；试验组两种鼠脾脏中ZBTB20、 Blimp1 mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

图1 小鼠胸腺、淋巴结免疫组化观察(DAB，×100)

组别淋巴结ZBTB20 Blimp1 胸腺ZBTB20 Blimp1 脾脏ZBTB20 Blimp1 试验组 MRL/lpr鼠1.354±0.8521.653±1.3201.654±0.9521.453±0.9202.354±1.9321)3.825±2.1322) NZB/WF1鼠1.175±1.0391.612±1.3351.435±1.1391.635±1.1353.425±2.1391)3.915±1.9312)对照组 1.131±0.9541.427±0.9821.431±0.9141.577±1.0820.731±0.6140.622±0.602

3 讨 论

SLE主要病理改变是出现全身炎症反应与血管异常，全身产生超过100种自身抗体〔2〕。其中，B细胞可分化为短寿命浆细胞和长寿命浆细胞，目前大多数靶向药物仅能清除可分裂的B淋巴细胞，而无法清除长寿命浆细胞及其产生的抗体，这可能会导致SLE病情反复发作，因此，找到与SLE发生、发展相关的物质改变有利于加深我们对疾病的认识〔3〕。

ZBTB20是锌指蛋白家族中的一种，又叫树突细胞来源的POZ锌指蛋白，锌指蛋白家族成员在N端处有一个典型的BTB/POZ结构域，可以介导蛋白质与蛋白质间的相互作用;而位于C 端的数个C2H2结构域可以与DNA 序列结合〔4〕。ZBTB20可以通过调控免疫细胞，诱导机体产生异常的体液免疫反应，从而参与到自身免疫性疾病的发病当中。曾有人对上千例SLE患者进行易感基因筛查，发现了ZBTB20是SLE的新的易感基因〔5〕。同时有实验表明，狼疮小鼠脾脏中的ZBTB20 mRNA含量较对照组明显升高，提示ZBTB20与 SLE高度相关性〔6〕。Blimp1是一种包含5个锌指结构和PR结合区的蛋白，由prdm1基因表达，是诱导B淋巴细胞向浆细胞分化的主调控子，Blimp1也是SLE的一种易感基因〔7〕。有研究表明，在SLE小鼠模型的脾脏、淋巴结、肝脏、肾脏等组织中Blimp1表达增加〔8〕，这与本实验结果相吻合。同时有研究显示IRF4-ZBTB20-Blimp1通路在调控B细胞的分化成熟及诱导分泌抗体中发挥重要作用。

有研究表明，NZB/WF1狼疮小鼠的长寿浆细胞主要集聚于脾脏中且Blimp1表达的增加伴随着长寿浆细胞及抗体的增加〔9〕，但Blimp1是否参与并影响B淋巴细胞向长寿浆细胞的分化，以及ZBTB20、Blimp1通过何种机制参与SLE的发生、发展当中，目前仍不清楚。

综上所述，狼疮小鼠脾脏中Blimp1与ZBTB20高表达，可能与SLE的发生、发展有关。

4 参考文献

1牟 琳，张卓莉.2015年系统性红斑狼疮研究新进展〔J〕.中华临床免疫和变态反应杂志,2016;10(3):276-80.

2张文兰,白 力,胡同平.抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗体和抗β_2糖蛋白1抗体在系统性红斑狼疮患者中的意义〔J〕.免疫学杂志,2017;33(1):59-62.

3Bakshi J,Ismajli M,Rahman A.New therapeutic avenues in SLE〔J〕.Best Pract Res Clin Rheumatol,2015;29(6):794-809.

4Zhang W,Mi J,Li N,etal.Identification and characterization of DPZF,a novel human BTB/POZ zinc finger protein sharing homology to BCL-6〔J〕.Biochem Bioph Res Commun,2001;282(4):1067-73.

5Lee HS,Kim T,Bang SY,etal.Ethnic specificity of lupus-associated loci identified in a genome-wide association study in Korean women〔J〕.Ann Rheum Dis,2014;73(6):1240-5.

6Elmann A,Sharabi A,Dayan M,etal.Altered gene expression in mice with lupus treated with edratide.a peptide that ameliorates the disease manifestations〔J〕.Arth Rheum,2007;56(7):2371-81.

7邓少丽,胡福泉,蹇 锐,等.抑制Blimp-1表达导致浆细胞去分化〔J〕.免疫学杂志,2006;22(2):141-6.

8Zhou Z,Li A,Wang Z,etal.Blimp-1 siRNA inhibits B cell differentiation and prevents the development of lupus in mice〔J〕.Hum Immunol，2013;74(3):297-301.

9Chevrier S,Emslie D,Shi W,etal.The BTB-ZF transcription factor Zbtb20 is driven by Irf4 to promote plasma cell differentiation and longevity〔J〕.J Exp Med，2014;211(5):827-40.