PAK6基因对人乳腺癌放疗敏感性及细胞凋亡影响及机制

宋 锐 袁金金 侯 歌 杨 军 陈晓娟 刘宗文

(郑州大学第二附属医院肿瘤放疗科，河南 郑州 450014)

乳腺癌发病率在全部恶性肿瘤中占10%左右，在女性恶性肿瘤中位居第二位，仅次于子宫癌〔1〕。乳腺癌诱发原因较多，遗传、生活环境等均与乳腺癌的发生有关，其发病机制复杂，是多种基因共同作用的结果。目前常见的治疗乳腺癌的方法有手术治疗、放化疗。由于大多数患者在确诊时已经是乳腺癌的中晚期，放疗成为治疗乳腺癌的重要辅助手段〔2〕。提高乳腺癌放疗敏感性成为目前研究的热点。P21激活的蛋白激酶(PAK)6在肺癌、前列腺癌、舌鳞癌、胰腺癌等癌组织中过度表达，能够促进肿瘤发生〔3～5〕。研究表明，抑制PAK6表达后，能够促进癌细胞凋亡，抑制癌症发展〔6〕。Wnt信号通路参与肿瘤发展，在肿瘤组织中过度激活，其关键基因β-连环蛋白(catenin)和下游靶基因c-myc均表达升高，并且参与癌基因和抑癌基因对癌症的调控过程〔7〕。本研究旨在探讨PAK6对乳腺癌细胞放疗敏感性和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞 乳腺癌细胞MDA-MB-468购自中国科学院细胞库。

1.2主要仪器及试剂 反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒、组织蛋白提取试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；PAK6小干扰RNA(siRNA)和阴性对照序列(siRNA对照)购自上海吉玛生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；β-catenin单克隆抗体、c-myc单克隆抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology ；流式细胞仪购自美国BD。

1.3细胞培养及细胞转染 乳腺癌细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，观察细胞密度生长至90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。取培养至对数生长期的乳腺癌细胞，消化后，种植到6孔细胞培养板中(每孔106个细胞)培养，观察细胞密度达到60%时，将细胞培养液换成不含胎牛血清的不完全培养液，放在37℃孵育60 min。用Lipofectamine 2000将PAK6 siRNA组和siRNA对照组转染至乳腺癌细胞中，以未转染组的细胞为对照，放在37℃培养48 h后，Western印迹和qRT-PCR检测细胞中PAK6水平。

1.4qRT-PCR检测PAK6表达 取1.3中转染后48 h的细胞，加入Trizol裂解液混合充分裂解后，加入Trizol裂解液1/5体积的三氯甲烷，剧烈震荡15 s，放在室温环境下静置15 min，12 000 r/min，4℃离心20 min，吸取水相层至EP管中，加入Trizol裂解液1/2体积的异丙醇，混合后，静置10 min，12 000 r/min，4℃离心20 min，加入乙醇洗涤两次，晾干后，用紫外分光光度计检测提取的RNA浓度及纯度。按照反转录试剂盒说明书反转录合成PAK6 cDNA，qRT-PCR试剂盒检测PAK6 mRNA水平。内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。根据2-△△Ct法计算PAK6水平。△Ct=PAK6 Ct值-GAPDH Ct值。反应程序为：95℃ 3 min，95℃ 15 s，58℃ 1 min重复40个循环，72℃ 7 min。PAK6上游引物为5′-CCGAATTCATGTTTGGGAAGAAAAAGAA-3′，下游引物5′-ATCTCGAGTCGAGAGGCTGCTCTCTGATACTCC-3′。GAPDH上游引物为5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.5Western印迹检测PAK6表达 取1.3中转染后48 h的细胞，提取细胞中的总蛋白，BCA定量检测试剂盒检测蛋白浓度。取蛋白样品，加入等体积的2×加样缓冲液混合后，放在100℃中煮沸5 min使蛋白变性。将变性蛋白样品加入到上样孔中，每孔加入50 μl的蛋白样品，电泳初始电压为80 V，电泳30 min后，120 V至电泳结束。将蛋白凝胶取出后，放在缓冲液中浸泡10 min。将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，转膜条件为：100 mA。用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭30 min后，加入一抗(800倍稀释，4℃孵育过夜)、二抗(1 000倍稀释，室温下孵育60 min)依次反应后，曝光，以GAPDH为内参，分析蛋白表达水平。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 取转染48 h后的乳腺癌细胞，吸除细胞培养液，胰蛋白酶消化后，收集3×106个细胞，冰预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞两次，加入结合缓冲液200 μl重悬细胞，各加入5 μl碘化丙啶(PI)和膜联蛋白(V-FITC)，充分混匀后放在避光环境中，室温静置15 min，加入300 μl的缓冲液，用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.7细胞克隆实验 取处于对数生长期且转染48 h后的乳腺癌细胞，胰蛋白酶消化后，离心，弃酶消化液，接种至12孔细胞培养板中，每孔加入105个细胞，放在37℃，5% CO2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，分别用0、2、4、6、8 Gy剂量照射细胞(照射条件为：200 kV，10 mA，剂量率为0.287 Gy/min)，培养12 d。肉眼观察细胞克隆形成后，弃上清液，加入PBS洗涤细胞3次，甲醇固定30 min，结晶紫染色20 min，用自来水小心冲洗染液，在室温下干燥。显微镜下观察细胞形成的克隆数，拟合剂量存活曲线。

1.8Western印迹检测细胞中β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表达 取对数生长期转染后的乳腺癌

细胞，培养48 h后，Western印迹检测细胞中β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表达。

1.9统计学处理 采用SPSS22.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.13组PAK6表达 PAK6 siRNA组细胞中的PAK6 mRNA和蛋白水平均明显低于未转染组(P<0.01)。siRNA对照组PAK6 mRNA和蛋白水平与未转染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。PAK6 siRNA能够干扰乳腺癌细胞中PAK6的表达。见图1，表1。

图1 Western印迹检测转染后乳腺癌细胞中PAK6表达

组别PAK6 mRNAPAK6 蛋白未转染组1.00±0.111.32±0.08siRNA对照组1.01±0.091.34±0.14PAK6 siRNA组0.45±0.071)0.34±0.051)

与未转染组相比：1)P<0.01

2.2各组细胞凋亡影响比较 PAK6 siRNA组细胞凋亡率〔(36.41±4.75)%〕与未转染组〔(11.66±1.67)%〕相比明显升高(P<0.01)。siRNA对照组细胞凋亡率〔(11.36±1.85)%〕与未转染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。干扰PAK6 表达能够促进乳腺癌细胞凋亡。

图2 干扰PAK6对乳腺癌细胞凋亡影响

2.3各组细胞放疗敏感性比较 PAK6 siRNA组细胞存活分数(SF2)降低，放疗增敏比为：1.896。干扰PAK6能够增加乳腺癌细胞放疗敏感性。见表2。

2.4各组β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3表达 PAK6 siRNA组与未转染组比较，β-catenin、c-myc表达显著降低，酶切Caspase-3表达显著升高(均P<0.01)。见表3，图3。

表2 单击多靶模型参数值

图3 Western印迹检测干扰PAK6后乳腺癌细胞中 β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表达

组别β-cateninc-myc酶切Caspase-3未转染组0.58±0.070.64±0.050.32±0.06siRNA对照组0.59±0.060.65±0070.31±0.08PAK6 siRNA组0.15±0.061)0.18±0.061)0.99±0.111)

与未转染组相比：1)P<0.01

3 讨 论

PAK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，哺乳动物含有6个亚型，在细胞形态维持、骨架支撑等方面具有调控作用〔8〕。研究表明，PAK6参与癌症的发展，在癌症组织中表达上调，能够调控细胞的增殖、凋亡等过程〔9〕。Gao等〔10〕在皮肤鳞状细胞癌组织中发现，PAK6 mRNA的表达水平是正常组织的2倍。Chen等〔11〕通过免疫组化发现，PAK6在子宫内膜癌组织和正常内膜组织中的阳性表达率分别为46.88%和22.5%。Mitsudomi等〔12〕通过转染PAK6 siRNA发现，干扰PAK6表达后能够抑制非小细胞肺癌侵袭，细胞侵袭能力约为原来细胞的一半。随着研究的不断深入，在结肠癌、胃癌、原发性肝癌等癌组织中均发现有PAK6表达异常升高〔13〕。本研究在体外以乳腺癌细胞为研究对象，通过转染PAK6小干扰RNA进一步发现，干扰PAK6表达后能够抑制乳腺癌细胞的凋亡，并且能够增加乳腺癌细胞放疗敏感性。温星桥等〔14〕发现，干扰前列腺癌细胞株LNCaP中PAK6表达后能够促进前列腺癌细胞的凋亡。Zhang等〔15〕研究表明，干扰PAK6后能够增加前列腺癌细胞的放疗敏感性，促进前列腺癌细胞凋亡。这些研究结果均说明，干扰PAK6能够促进癌细胞的凋亡，增加癌细胞的放疗敏感性。

细胞凋亡是一个复杂的过程，受到多种基因的严格调控，是一系列反应共同作用的结果。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成员之一，是细胞凋亡的执行因子，Caspase-3活化后，酶切Caspase-3表达升高，细胞凋亡进入不可逆阶段〔16〕。研究表明，多种抑癌基因和癌基因能够通过调控Caspase-3的活化而干扰癌细胞凋亡过程〔17〕。本研究结果说明，干扰PAK6能够通过作用于酶切Caspase-3而影响乳腺癌细胞的凋亡过程。

Wnt基因是从乳腺癌小鼠中克隆出来的一种癌基因，能够促进肿瘤的发生，目前发现的有19个亚型，Wnt信号通路是一个较为复杂的信号转导通路，由多个作用位点和多个环节共同组成〔18〕。经典的Wnt信号通路与β-catenin有关，β-catenin能够与其他蛋白分子结合形成复合物，在外界因素的作用下，β-catenin能够调控相关蛋白的表达〔19，20〕。c-myc是Wnt信号通路的下游靶基因，Wnt信号通路激活后能够促进c-myc的表达〔21〕。Cleary等〔22〕在乳腺癌中有Wnt信号通路的异常激活。冬凌草甲素能够调控Wnt信号通路影响乳腺癌MCF-7细胞的生物学特性〔23〕。 本研究结果提示，干扰PAK6能够抑制乳腺癌细胞中Wnt信号通路的激活。

综上所述，干扰PAK6表达能够促进乳腺癌细胞凋亡，增加乳腺癌细胞放疗敏感性，作用机制可能与抑制Wnt信号通路的激活有关。本研究只用了一种乳腺癌细胞，且只在体外进行了相关研究，后续会继续在体内和体外继续研究PAK6对其他几种乳腺癌细胞凋亡及放疗敏感性的影响。

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