山茶籽油与不同雌激素受体-β基因型交互作用对广西百色壮族妇女绝经后骨质疏松的影响

李 海 杨 洁 陈建海 黄炳臣 黄海玲 王金花 方晓燕 黎 飚

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

老年性骨质疏松(OP)中绝经后OP(PMOP)发病率最高，临床症状最重，与营养、种族、遗传和年龄有关，PMOP的骨质流失大于骨质生成，与卵巢功能降低，女性激素水平下降，引起破骨细胞吸收骨质增加有关。山茶籽油内含植物性雌激素〔1〕。研究表明骨质流失与雌激素受体(ER)的不同基因型有关〔2〕。本课题拟探讨ER-β不同基因型与山茶籽油相互作用对防治广西百色壮族妇女PMOP的影响。

1 材料和方法

1.1对象 长期非食用山茶籽油(NECO)广西百色壮族40～80岁妇女619人，长期食用山茶籽油(ECO)40～80岁妇女598人，排除肝、肾、肺、心及内分泌等器官疾患，无摘除卵巢病史，也未服用激素等对骨代谢有影响药物。检测对象均无长时间外出经历，3代祖宗均属纯壮族。ECO组长期食用山茶籽油，极少食用其他植物油或动物油，而NECO组长期食用花生油或动物油。

1.2超声骨密度测定 采用法国生产的超声定量骨密度仪(QUS)检测右侧跟骨超声宽带衰减值(BUA)。每次测定前均由专门技术员开机进行校对。按照我国OP临床诊断标准，与广西百色地区相关人群正常的骨峰值(PBM)比较BUA减少值≤2.0为正常组，>2.0为PMOP组。

1.3ER基因多态性测定

1.3.1设计和合成引物 根据相关文献进行引物设计〔3〕，ER-β基因扩增Rsa I位点上游引物：5′-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3′，下游引物：5′-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3′。特异性扩增ER-β基因Alu多态性相应位点一段DNA引物的序列P1：5′-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3′，P2：5′-AATGAGGGACCACAGCA-3′，PCR终产物片段长度为307 bp。

1.3.2提取DNA模板 用碘化钠(NaI)DNA提取法，取乙二胺四乙酸抗凝的全血100 μl加入灭菌双蒸馏水100 μl进行混匀，加入6 mol/L NaI 200 μl进行涡旋震荡30 s，再加入相等体积的异戊醇/氯仿(1∶24)进行涡旋震荡30 s，经离心取其上清液再加入0.6倍体积的异丙醇并拌匀，4℃静置15 min，经离心沉淀后用70%乙醇洗涤1次，晾干物溶于TE缓冲液中，测定提取模板DNA后，置于-20℃冰箱保存备用。

1.3.3PCR扩增〔4〕反应体系50 μl，其中内含有10倍缓冲扩增液、dNTPs各200 μmol/L，引物P1和P2各0.4 μmol/L，DNA模板物0.1 μg。置于热循环仪内(Bio-Rad型，日本)中95℃预变性5 min，再注入Taq DNA聚合酶2.5 U。94℃变性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，72℃末次进行延伸10 min，循环35次。

1.3.4扩增产物用限制性酶进行酶切 取PCR扩增产物10 μl,用10 U Rsa Ⅰ、8 U Alu Ⅰ于37℃酶切3 h。酶切反应终止的产物经8%聚丙烯酰胺电泳凝胶电泳，再进行溴化乙啶(EB)染色，用DNA标准物的片段长度作为参照，灯光下观察结果和拍色带照片。

1.4统计处理 使用SSPS16.0软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1超声骨质密度测量结果 NECO组骨质密度正常379例(61.2%)，PMOP 240例(38.8%)。ECO组骨质密度正常419例(70.1%)，PMOP 179例(29.9%)。两组PMOP发病率差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2ER-β 基因型多态性分析 ER基因多态性采用Rsa Ⅰ酶进行酶切可以区分出3个基因型：rr基因型(终产物为156 bp的1个条带)，Rr基因型(终产物为156、125 bp的2个条带)，RR基因型(终产物为125 bp的1个条带)，见图1；采用Alu Ⅰ酶进行酶切可以区分出3个基因型：aa基因型(307 bp)，Aa基因型(307、240、67 bp的3个条带)，AA基因型(240、67 bp的2个条带)，见图2。

图1 ER-β Rsa Ⅰ酶切基因多态性的凝胶电泳图谱

图2 ER-β Alu Ⅰ酶切基因多态性的凝胶电泳图谱

2.3正常组与PMOP组ER-β基因多态性比较 两组ER-β的RsaⅠ酶切rr基因型频率差异有统计学意义(P<0.05)。两组ER-β AluⅠ酶切基因型频率差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4ER-β Rsa Ⅰ酶切基因型多态性在ECO PMOP组与NECO PMOP组的分布比较 ECO PMOP组与NECO PMOP组 RR、Rr 和rr基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5ER-β AluⅠ酶切基因型多态性在NECO PMOP组与ECO PMOP组的分布比较 ECO PMOP组携带Aa基因型频率分布明显少于NECO PMOP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表2 正常组和PMOP组ER-β RsaⅠ、ER-β Alu Ⅰ酶切基因型多态性分布比较〔n(%)〕

与对照组比较：1)P<0.01

表3 NECO组和ECO组ER-β Rsa I酶切基因型多态性分布比较〔n(%)〕

表4 NECO PMOP组和ECO PMOP组ER-β XbaⅠ酶切基因型频率多态性分布比较〔n(%)〕

与ECO PMOP组比较：1)P<0.05

3 讨 论

流行病学调查证实OP具有较强的遗传性〔3〕，近年研究表明ER-β是OP密切相关基因之一〔4〕。Schuit等〔5〕研究说明ER-β基因多态性影响绝经后妇女雌激素表达水平，而绝经后妇女雌激素水平高低个体间有很大差异，在PMOP发生病理上起到决定性作用，因为雌激素可以促进成骨细胞形成骨质，而抑制破骨细胞对骨质溶解吸收，因此，ER-β基因的遗传变异与PMOP密切相关。女性激素包括雌激素和孕激素，替代疗法一般效果良好，但存在不良反应特别是治疗后的并发症，如乳腺癌和子宫内膜癌等。实验证实植物性雌激素在体内有双向调节作用〔6〕。当体内雌二醇处于较低水平时，进入体内植物性雌激素可以转化高活性雌激素发挥雌激素样作用，当体内雌二醇处于较高水平时，进入体内植物性雌激素与受体相结合时起到抑制效应。山茶籽油内含的植物性雌激素对PMOP的实验动物模型疗效明显〔1，7〕。

本研究结果表明，长期ECO有防治PMOP的作用，rr基因型更易患PMOP，带有这种基因型妇女要提前做好PMOP的防治。Aa基因型是与山茶籽油起交互作用对PMOP有防治作用的敏感基因。内含这种基因的绝经妇女ECO对PMOP的防治效果最好。

4 参考文献

1李 海,陈建海,王金花,等.山茶籽油对绝经后骨质疏松症治疗作用的实验研究〔J〕.中国妇幼保健,2012;27(23):3646-9.

2Ascenzi P,Bocedi A,Marino M.Structure-function relationship of estrogen receptor alpha and beta:Impact on Human Health〔J〕.Mol Aspects Med,2006;27(4):299-402.

3Obemayer PB,Chararas C,kotschan S,etal.Genetic background of osteoporosis〔J〕.Acta Med Austriaca,2000;27(1):18.

4Ichikawa S,Koller DL,Peacock M,etal.Polymorphisms in the estrogen receptor beta(ESR2)gene are associataed with bone mineral density in Caucasian men and women〔J〕.J Clin Endocrinol Meta,2005;90(11):5921-7.

5Schuit SC,de Jong FH,Stolk L,etal.Estrogen receptor alphu gene polymorphisms are associated with estradiol levels in postmenop ausal uomen〔J〕.Eur Endocrinol,2005;153(2):327-34.

6巴文君,孙丽萍,张秋菊,等.补骨脂对初老小鼠体内雌激素水平作用实验研究〔J〕.中医药学报,2010;38(5):19-22.

7唐 玲，冯宝民，史丽颍，等.山茶属植物的抗骨质疏松作用〔J〕.中药材，2008;31(10)：1540-4.