氮源对蛹虫草产量及药效物质产量影响的研究

李园园，杨 帆，姜美娜，许舒文，寇嘉宾，刘丽丽

（天津师范大学 生命科学学院，天津 300387）

人工栽培蛹虫草可增加农业生产的经济效益，蛹虫草因其含有极高的药用价值，其产量的增加要比一般农作物的产量增加带来更高的经济效益。蛹虫草中含有丰富的药效物质成分，其药效物质生物活性成分与天然冬虫夏草相似，而成为冬虫夏草最常用的替代品。研究表明，蛹虫草的生物活性成分主要有腺苷、虫草素、虫草多糖和虫草酸等。腺苷具有改善心脑血液循环、松弛血管平滑肌、防止心率失常等生理活性，是深层大脑刺激效果的关键，可用来治疗帕金森症和有严重震颤患者[1]。虫草素具有抗肿瘤、增强机体免疫力、抑菌与抗炎作用等作用[2]。虫草多糖是虫草中最重要、最丰富的药理活性物质，有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等功效[3]。虫草酸，即D-甘露醇，现已被认为是发酵虫草菌丝体中活性成分的重要测试指标之一，具有利尿脱水、提高血浆渗透压、镇喘祛痰、抗自由基等药理作用[4]。本试验通过不同培养基培养蛹虫草，筛选出生产药效物质含量最高的蛹虫草的培养条件，以期为大规模液体发酵用于农业栽培提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 蛹虫草菌种，由天津师范大学微生物实验室保存。

腺苷标准品（纯度≥98%）、葡萄糖标准品（纯度≥98%）、虫草素标准品（纯度≥98%）、甘露醇标准品（纯度≥98%）购于天津泰艾瑞科技有限公司；甲醇（色谱纯）、蒽酮（分析纯）、硫酸（分析纯）、高碘酸钠（分析纯）、醋酸铵（分析纯），均购于天津瑞博星科技有限公司；蒸馏水、超纯水。

1.1.2 栽培基质 PDA培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 仪器与设备

循环水式真空泵SHD-D（Ⅲ），巩义市予华仪器有限公司；高效液相色谱仪Waters Alliance 2695，美国Waters公司；医用超净工作台 SW-CJ-IF，苏州安泰技术有限公司、超纯水机UItra CLEAR，德国SG公司；紫外可见分光光度计 UA 2550，Shimadzu。

1.2 试验方法

1.2.1 产量测定方法 取生长至30 d的蛹虫草菌丝体，3 000 r·min-1离心6 min，去除上清液，置于60 ℃烘箱中烘干，测干重并记录。

1.2.2 标准溶液制备 腺苷和虫草素标准品的制备：分别准确称取腺苷、虫草素标准品各4 mg，溶入10 mL超纯水中，制得400 µg·mL-1的腺苷、虫草素标准储备液。吸取腺苷、虫草素标准储备液适量，分别制得浓度为1、5、10、15、20、25、30 和 35 µg·mL-1的系列浓度标准品溶液。

虫草多糖标准品的制备：称取10 mg葡萄糖标准品，溶于10 mL蒸馏水中，制得1 mg·mL-1的葡萄糖标准品储备液，备用。吸取1 mL葡萄糖储备液用蒸馏水稀释至10 mL，得0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准液，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 的 0.1 mg·mL-1葡萄糖标准液于试管中，分别加蒸馏水至1 mL，制得虫草多糖标准品溶液。

虫草酸标准品的制备：称取10 mg甘露醇标准品，溶于10 mL蒸馏水中，制得1 mg·mL-1的甘露醇标准品储备液，备用。吸取1 mL甘露醇储备液用蒸馏水稀释至10 mL，得0.1 mg·mL-1的甘露醇标准液，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 的 0.1 mg·mL-1甘露醇标准液于试管中，分别加蒸馏水至1 mL，制得虫草多糖标准品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取烘干的蛹虫草菌丝体，研磨成粉末状。称取0.01 g蛹虫草菌丝体粉于1.5 mL离心管中，加入1 mL超纯水，超声提取15 min，3 000 r·min-1离心6 min，吸取上清液即为供试品溶液。

1.2.4 药效物质产量测定方法 腺苷和虫草素用高效液相色谱测定，色谱条件为：Waters C18柱；流动相：甲醇-水（15∶85）；检测器：紫外检测器，检测波长为260 nm; 柱温30 ℃；进样量20 μL, 流速 1 mL·min-1。

虫草多糖用蒽酮硫酸法测定，即取1 mL待测溶液于试管中，加入4 mL蒽酮硫酸溶液（0.2 g蒽酮溶于100 mL 80%浓H2SO4），摇匀，沸水浴10 min，取出迅速冷却至室温，用紫外分光光度计测定其在625 nm 处的OD值，对照品为蒸馏水代替待测品溶液做同样的操作。

虫草酸的测定用高碘酸钾比色法[4],取1 mL的待测溶液于试管中，加入1 mL高碘酸钾溶液，摇匀，室温反应10 min，加入2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液，摇匀，除去多余的高碘酸钾，然后加入4 mL 新配置的Nash试剂，放入53 ℃恒温水浴中15 min，使其呈色，之后迅速冷却至室温，用紫外分光光度计测定其在412 nm 处的OD值，对照品为蒸馏水代替待测品溶液做同样的操作。

1.2.5 数据分析 采用Excel软件对试验数据进行处理，并采用 SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草产量测定

蚕蛹粉中因含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和微量元素等营养物质，而成为蛹虫草栽培过程中常用的添加物，本试验以PDA培养基为基础，分别添加5%、10%和15%的蚕蛹粉浸提液为蛹虫草的栽培基质，对照为PDA培养基不添加蚕蛹粉浸提液，栽培培养蛹虫草，并测量蛹虫草的产量，测定结果见表1。

表1 氮源对蛹虫草产量的影响

由表1可知，栽培基质里添加蚕蛹粉浸提液确实能提高蛹虫草的产量，而且随着添加量的增加蛹虫草的产量呈先增加后减少的趋势，分析原因可能是蚕蛹粉浸提液比较粘稠，当其量达到一定程度时，会影响栽培基质的透气性，从而影响蛹虫草的产量。当栽培基质里蚕蛹粉浸提液的添加量为10%时，蛹虫草的产量最高，且显著高于其他各组，因此选择PDA培养基添加10%蚕蛹粉浸提液为获得蛹虫草产量最大的最佳培养条件。

2.2 蛹虫草药效物质产量的测定

2.2.1 标准曲线的绘制 分别取腺苷和虫草素标准品溶液按照1.2.4色谱条件进行测定，以标准溶液质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

腺苷标准曲线：

y=75 674x+7 648.6，R2=0.999 9；

虫草素标准曲线：

y=87 031x+19 455，R2=0.999 2。

取已制好的虫草多糖标准品溶液，按照1.2.4蒽酮硫酸法测定，以虫草多糖标准品溶液的质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得虫草多糖标准曲线：y=0.010 2x+0.093 4，R2=0.999 9。

取已制好的虫草酸标准品溶液，按照1.2.4高碘酸钾比色法测定，以虫草多酸标准品溶液的质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得虫草酸标准曲线：y=0.010 4x+0.022，R2=0.999 7。

2.2.2 精密度试验 分别取浓度为 40 µg·mL-1的腺苷、虫草素标准品，按照1.2.4色谱条件，连续进样六次，测得腺苷和虫草素的峰面积，计算得RSD分别为0.059%和0.141%，表明仪器的精密度良好。分别取浓度为40 µg·mL-1的葡萄糖、甘露醇标准品，按照1.2.4 测定方法，连续测定6次，记录OD值，计算得RSD分别为0.937%和1.114%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取同一批样品，精密称取冬虫夏草菌丝体粉6份，按照1.2.3制备供试品溶液，按照1.2.4测定条件测定腺苷、虫草素，虫草多糖和虫草酸含量，计算得RSD分为1.463%，2.213%，3.672%，1.853%，证明本方法的重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取冬虫夏草菌丝体粉，按照1.2.3制备供试品溶液，按照1.2.4测定条件分别在0、2、4、6、8 h测定，记录腺苷和虫草素的峰面积，记录虫草多糖和虫草酸的OD值，计算得腺苷、虫草素，虫草多糖和虫草酸的RSD分别为6.747%，2.262%，2.969%和1.607%，证明冬虫夏草菌丝体中的腺苷、虫草素、虫草多糖和虫草酸含量在8 h内稳定。

2.2.5 蛹虫草药效物质产量的测定 蛹虫草产量的变化必然引起蛹虫草药效物质产量的变化，本研究在测蛹虫草产量的基础上进而测定了不同处理组蛹虫草菌丝体粉和市售蛹虫草菌丝体粉中的药效物质的含量，结果如表2～5。

表2 氮源对蛹虫草菌丝体腺苷产量的影响 （μg·mg-1）

表3 氮源对蛹虫草菌丝体虫草素产量量的影响 （μg·mg-1）

表4 氮源对蛹虫草菌丝体虫草多糖产量的影响 （μg·mg-1）

表5 氮源对蛹虫草菌丝体虫草酸产量的影响 （μg·mg-1）

由表2、3、5可以看出，随着蚕蛹粉浸提液添加量的不同，蛹虫草中的腺苷、虫草素、虫草酸含量呈先增加后降低的趋势，五个处理组中，蛹虫草腺苷、虫草素、虫草酸含量的差异几乎都具有统计学意义（P≤0.05）。五个处理组中蛹虫草腺苷含量分别为2.103 μg·mg-1，2.836 μg·mg-1，3.411 μg·mg-1，2.115 μg·mg-1，1.659 μg·mg-1，虫草素含量分别为 2.257 μg·mg-1，3.941 μg·mg-1，6.281 μg·mg-1，2.498 μg·mg-1，3.462 μg·mg-1，虫草酸含量分别为28.756 μg·mg-1，33.743 μg·mg-1，42.756 μg·mg-1，19.795 μg·mg-1，31.679 μg·mg-1。其中PDA培养基添加10%蚕蛹粉浸提液时，蛹虫草的腺苷、虫草素和虫草酸的含量均最高，分别为 3.411 μg·mg-1，6.281 μg·mg-1和 42.756 μg·mg-1，显著高于其他各组，故选择PDA培养基添加10%蚕蛹粉浸提液为蛹虫草产腺苷、虫草素和虫草酸含量最高的栽培基质。

由表4可以看出，蛹虫草中的虫草多糖的含量随着蚕蛹粉浸提液添加量的增加而增加，5个处理组中，蛹虫草虫草多糖含量的差异几乎都具有统计学意义（P≤0.05）。5个处理组中蛹虫草虫草多糖含量分别为1.322 μg·mg-1、4.051 μg·mg-1、6.600 μg·mg-1、10.084 μg·mg-1和6.122 μg·mg-1，其中添加15%蚕蛹粉浸提液的PDA培养基中蛹虫草的虫草多糖含量最高，为10.084 μg·mg-1，显著高于其他各组，但考虑到蛹虫草的综合药效最高，故选择PDA培养基添加10%的蚕蛹粉浸提液为蛹虫草产药效物质含量最高的栽培基质。

3 结论与讨论

蛹虫草经济价值主要体现于其产量和药效成分含量的高低，随着蛹虫草生产规模的扩大和产品的开发，生产药效价值高的蛹虫草日益变成人们的迫切需求[5]。本研究测定了氮源对蛹虫草产量及4种药效物质腺苷、虫草素、虫草多糖和虫草酸的含量的影响，并与市售蛹虫草菌丝体粉中的这4种药效成分含量做了对比。结果表明，PDA培养基添加10%蚕蛹粉浸提液时蛹虫草的产量最高，药效物质含量也最高，且显著高于市售蛹虫草菌丝体粉的药效成分含量，因此选用PDA培养基添加10%蚕蛹粉浸提液作为蛹虫草的最佳栽培基质，可用于蛹虫草的大规模栽培种植。本研究中蛹虫草腺苷、虫草素和虫草酸含量随着培养基中蚕蛹粉含量的升高而出现先上升后下降的趋势，这与李菲等[6]添加蚕蛹粉对蛹虫草生长及子实体有效成分的影响的研究结果一致，而虫草多糖含量随着培养基中蚕蛹粉浸提液含量的升高而升高，其具体影响机制还有待研究。

[1]于戈，王丽，胡欣蕾，等.响应面法优化蛹虫草固态发酵产物虫草素与腺苷综合提取工艺[J/OL].食品科学，1-12(2017-08-02). http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20170802.1547.048.html.

[2]刘桂君，周思静，杨素玲，等.蛹虫草中虫草素的研究进展[J].食品科学，2013，34（21）： 408-413.

[3]张杰，孙源.超声提取蛹虫草多糖及其抗氧化活性分析[J].食品科技，2013，38（5）：203-207.

[4]蔡友华，范文霞，刘学铭，等.比色法测定巴西虫草菌丝体中虫草酸的含量[J].现代食品科技，2008，24（1）：76-79.

[5]陆巍杰，唐永范，高瑞栋.HPLC法测定北冬虫夏草和常见食用菌中腺苷和虫草素[J].现代药物与临床，2011，26（4）：313-315.

[6] 李菲，王忠，卞文印，等.添加蚕蛹粉对蛹虫草生长及子实体有效成分的影响[J].武学，2016（32）：69-73.