小麦幼胚离体培养初步研究

李思琪，孙 宁，崔驰浩

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）

小麦为中国三大粮食作物之一，2012年总产量达到1.2亿t左右，是中国半数以上人的主粮。随着人民生活水平的提高，对小麦产量及品质有了更高的需求，因此，培育优良小麦品种，提高产量、改善品质等研究具有重要意义。利用转基因技术将特定的外源基因导入小麦中，从而定向改良小麦品种，为小麦遗传育种提供了一条新途径，而建立高效的再生体系是小麦遗传转化的关键环节之一。研究表明，在筛选小麦离体培养再生体系时，幼胚是较好的试验材料，且目前已获得了再生小麦苗。有学者认为从小麦幼胚离体培养得到的小麦苗，其后代籽粒胚乳醇溶蛋白亚基和蛋白质含量均有变化，建立幼胚高效再生体系并进行遗传转化，可改良其品质。

本文以小麦品种辽春17幼胚为试材，对其进行离体培养研究，以获得高频高效的再生体系，为小麦的遗传转化研究提供技术基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

取辽春17开花后13～16 d的幼穗，剥离籽粒，用75%乙醇浸泡40～60 s，无菌水冲洗4～5次，再用0.1% HgCl2表面灭菌7.5 min，无菌水冲洗6～7次后，剥去幼胚，接种于愈伤组织诱导培养基上。

1.2 培养基

培养基均以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g·L-1、0.7%琼脂。其他成分见表1，调节pH值至5.8～6.0，120 ℃高压灭菌20 min，幼胚愈伤组织分化培养基激素配比见表2。

表1 幼胚愈伤组织诱导与继代培养基

表2 幼胚愈伤组织分化培养基激素配比

1.3 试验方法

幼胚愈伤组织诱导于25 ℃黑暗条件下培养，15 d后选取色泽鲜艳且致密的胚性愈伤组织，继代于愈伤组织继代培养基中(15 d继代1次)。分化培养采用光培养，光照强度2 000 Lx，光照时间为12 h·d-1，温度为25 ℃。接种后10 d左右统计出愈外植体数，观察并记录愈伤组织的颜色及质地。转入分化培养后实时观察，统计产生绿点的愈伤组织及分化出绿芽的愈伤数。出愈率、分化率计算公式如下 ：

出愈率/%=出愈外植体数÷接种外植体数×100%

分化率/%=分化出绿芽的愈伤数÷接种愈伤数×100%

2 结果与分析

2.1 小麦幼胚愈伤组织的诱导

辽春17幼胚接种后4～6 d即可诱导产生愈伤组织，10 d左右不同激素处理的愈伤组织诱导率产生明显差异。A组添加2,4-D（1 mg·L-1）、CH、Gln的处理平均出愈率高达93.8%，且出愈快，愈伤组织颜色鲜艳，致密，质量较好。添加VB1、麦草畏的两组处理出愈率反而有所降低（表3）。其中A2：2,4-D 1 mg·L-1、CH 200 mg·L-1、Gln 200 mg·L-1处理出愈率最高，为98.0%，说明添加VB1和麦草畏不如单独使用2,4-D（1 mg·L-1）、CH、Gln的效果好。

表3 小麦幼胚愈伤组织诱导试验结果

2.2 不同激素处理对愈伤组织分化的影响

不同激素对幼胚愈伤组织的分化率影响较大。在添加NAA(0.5 mg·L-1)的基础上，KT的促进效果明显优于6-BA与TDZ，培养基中添加适量的KT会获得较高的绿点率及分化率。其中D1处理的愈伤组织分化率最高为66.7%，而F1处理的组织分化率最低为35.4%（表4）。结果表明，MS培养基添加NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1为辽春17幼胚愈伤组织分化较为理想的培养基配方。

表4 幼胚愈伤组织分化培养结果

3 结论与讨论

生长素2,4-D被广泛应用于植物离体培养过程中促进细胞分裂与愈伤组织的获得。近年来，麦草畏也在小麦、大麦、玉米等禾谷类植物研究中用于愈伤组织的诱导。试验发现，在添加2,4-D 1 mg·L-1基础上，添加麦草畏1～4 mg·L-1反而会使幼胚出愈率降低，说明不同小麦品种在选择诱导愈伤组织形成的激素种类上有所不同。郭向云等研究表明，在小麦幼胚愈伤组织诱导、继代和分化的培养基中添加VB1有利于胚性愈伤组织的发生，可降低非胚性愈伤组织的发生频率，能显著提高小麦幼胚愈伤组织的分化能力。但在试验中发现添加VB1时小麦愈伤组织诱导率降低，因此，在今后研究中，应在保证高愈伤组织诱导率的基础上筛选VB1使用的最适浓度。

胚源愈伤组织再分化是形成小麦幼胚愈伤组织再生植株的关键环节。林毅等研究发现，在适宜的培养条件下，分化率能达到99%；但大多研究结果证明，再生率在不同基因型之间表现出较大的差异，同时，分化率与外植体类型、外源激素种类均有很大的相关性。本试验选用NAA与KT、6-BA、TDZ配合使用发现，NAA 0.5 mg·L-1与KT 1.0 mg·L-1配合使用分化率高达66.7%，与其他处理最低相差31.3%。

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