野生姜科植物土田七的外植体灭菌技术研究

潘 梅，符瑞侃，黄 赛，戚华莎，王景飞，吕德任(海南省农业科学院 热带园艺研究所，海南 海口 571100)

野生姜科植物土田七的外植体灭菌技术研究

潘 梅，符瑞侃，黄 赛*，戚华莎，王景飞，吕德任
(海南省农业科学院 热带园艺研究所，海南 海口 571100)

为筛选出土田七组织培养适宜的外植体类型及其消毒方法，为土田七的无性繁殖提供技术支持，以土田七的茎尖、幼嫩叶片和根茎作为外植体，采用75%酒精和0.1%HgCl22种灭菌剂进行消毒灭菌处理，研究了土田七组织培养中外植体的最佳灭菌方法。结果表明：茎尖的消毒相对容易，幼嫩叶片次之，根茎的消毒相对较难。茎尖采用75%酒精30 s+0.1%HgCl215 min的灭菌方法好；幼嫩叶片采用75%酒精10 s+0.1%HgCl25 min的灭菌方法好；根茎采用75%酒精30 s+0.1% HgCl230 min方法效果较好。

土田七；外植体；灭菌

土田七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Baker.) Craib ex loesener]又称姜三七、姜田七，是姜目姜科土田七属花卉，为多年生直立草本植物，分布于海南、广东、广西和福建[1]。土田七植株高20～30 cm，叶片披针形，花序从根茎抽出，10～15朵花聚生于钟状的总苞内，花白色，唇瓣中央具杏黄色斑，花期5～7月，可作盆栽和花坛花卉，是极具开发潜力的花卉资源。土田七可采用根茎繁殖，但繁殖系数低。利用组织培养技术建立土田七的快繁体系，则可以促进土田七种苗的快速繁殖与应用，目前尚无相关方面的报道。在植物组织培养过程中，无菌体系的建立是植物组织培养成功的关键，而外植体的选择及其消毒方法是影响无菌体系建立的重要因素。由于外植体材料取自自然生长的植株，带有较多的细菌和真菌，需对其进行消毒灭菌，要求既不损伤其组织材料保持生活力，使其在良好的培养条件下能正常生长和繁殖，又要杀灭带有的各种的微生物，只有筛选出成功的消毒方法，才能进行进一步的组织培养研究。本文以土田七的茎尖、幼嫩叶片的根茎作为外植体试材，对外植体类型和灭菌时间等进行研究，以期筛选出土田七组织培养适宜的外植体类型及其消毒方法，为土田七人工组织培养快速繁育技术的建立提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采自野外引种种于海南农科院热带园艺研究所苗圃的植株，以土田七的茎尖、叶片和根茎作为外植体试材。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌体系的建立 采回的外植体先用流水洗去表面污物，再用洗洁精液清洗，最后用自来水冲洗。在无菌条件下使用75%酒精和0.1% HgCl22种灭菌剂，设计不同的灭菌剂与灭菌时间组合，进行比较试验，分别筛选出适宜的组培外植体及3种不同外植体生长的最佳灭菌方法。灭菌后的外植体均用无菌水冲洗5次备用。

1.2.2培养方法 将茎尖切成长度为1.5 cm的小段，叶片切成1 cm见方的小块，根茎切成长约1 cm的小块，接种于启动培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。培养基中均加入30 g/L食用蔗糖，8 g/L卡拉胶，pH 6.0。培养温度(26±2) ℃，光照时间9 h/d，光照强度1 500 lx。

各处理接种50个外植体，培养25 d后分别统计污染率、死亡率、存活率和启动率。

污染率=污染的外植体数/接种的外植体数×100%；

死亡率=死亡的外植体数/接种的外植体数×100%；

存活率=存活外植体数/接种的外植体数×100%；

启动率=存活外植体启动数/存活外植体数×100%；

芽诱导率=诱导出全部芽数/存活外植体数×100%。

2 结果与分析

2.1 茎尖灭菌的处理效果

茎尖接种培养到第6天时，处理A1和A2开始出现污染；培养到第8天时，处理A3和A4也开始出现污染；在培养10～12 d时，污染发生较为集中，有外植体出现褐化死亡现象，18 d后无污染再发生。从表1可以看出，随着HgCl2消毒时间的延长，茎尖的污染率逐渐下降，死亡率则呈上升的趋势。其中，消毒5 min时，茎尖没有出现死亡，污染率最高，达 36%；消毒10 min时，茎尖死亡率只有2%，但污染率较消毒5 min的处理降低20%；消毒15 min时，污染率较低，为8%，但存活率则最高，达86%；消毒20 min时，死亡率增至16%，存活率降至78%。可见，0.1% HgCl2在 5～10 min内对茎尖外植体伤害不大，但灭菌效果差，达到20 min时，虽然有良好的灭菌效果，但对外植体伤害较大。综合污染率、死亡率和存活率3个指标，茎尖的最佳消毒时间为HgCl2消毒15 min。

表1 茎尖的灭菌方法及效果

2.2 幼嫩叶片灭菌的处理效果

土田七的叶片对酒精较为敏感，在预试验中，用75%酒精处理30 s，叶片褐化明显增多，以75%酒精处理10 s效果较好。叶片接种次日，处理B3～B4开始出现褐化；培养到第3天时，各处理均开始出现污染；第7天时，污染发生高峰；10天后，污染减少；20天后无污染再发生，污染多表现为霉菌污染。从表2可见，幼嫩叶片经75%酒精和0.1% HgCl2灭菌处理后有不同程度的损伤，随着0.1% HgCl2处理时间的延长，叶片污染的几率下降，但出现褐化死亡的几率增加。0.1% HgCl24 min时，对叶片的伤害小，叶片死亡率最低，为 6%，但污染率高达到30%；0.1% HgCl28～10 min时，表现出很好的抑菌效果，污染率最低，仅有2%～6%，但给叶片造成的伤害大，死亡率达到28%～38%；0.1% HgCl26 min，叶片污染率较低，但成活率最高，达到76%。因此，叶片最佳的处理方法为0.1% HgCl26 min，即能有效控制菌类的生长，又保证了叶片的正常生长。

表2 叶片的灭菌方法及效果

2.3 根茎灭菌的处理效果

相对于茎尖和叶片，土田七的根茎外植体灭菌较难，灭菌消毒所需时间相对较长。根茎接种后第3天开始出现污染，第7天的污染数量最多。从表3可见，根茎的污染率较茎尖和叶片外植体高很多，最低为30%，最高达到92%，原因可能是由于根茎生长在地下土壤中，带有的杂菌较多，而且表面不太光滑，影响灭菌效果。根茎与茎尖和叶片外植体对消毒剂的反应一致，随着0.1% HgCl2处理时间的延长，污染的几率下降，0.1% HgCl235 min处理的根茎污染率最低，为30%。同时根茎外植体对消毒剂的耐受能力强于茎尖和叶片，0.1%HgCl210～25 min时，无外植体死亡；0.1% HgCl230 min时，个别外植体于第5天开始变褐，约14 d软化腐烂，死亡率4%；当0.1% HgCl2消毒时间增加至35 min时，死亡率为14%，这可能是由于根茎外植体体积较大，不易对细胞组织造成伤害。从实验结果看，6种处理中以C5和C6有较好的灭菌效果，其污染率低，二者数值较为接近，但C6的死亡率较高，比C5高了10%，存活率则下降了6%，因此，处理C5即0.1% HgCl230 min应是根茎外植体适宜的灭菌方法。

表3 根茎的灭菌方法及效果

2.4 不同外植体的启动效果

茎尖接种次日出现抽长，培养12 d，芽高达到2cm；培养15 d，基部开始出现新芽；30 d时，成活外植体可有1～3个芽(图l：A)。叶片以叶背接入培养基，培养18 d叶片中部向上拱起卷曲，有个别外植体褐化，之后死亡；培养40 d，个别外植体开始出现愈伤组织(图l：B)。根茎培养16 d开始萌芽1～3个；30 d时，芽最高1.2cm(图l：C)。从表4看出，在同样的培养时间和培养条件下，茎尖的芽诱导率最高，达到191%；其次为根茎外植体，芽诱导率为167%；叶片的诱导率则为0；可见，土田七的组织培养外植体材料以茎尖为最佳，可以快速建立无菌体系。

表4 不同外植体的启动效果

图1 土田七不同外植体消毒后的生长情况(30 d)

3 结论与讨论

外植体的消毒和选择是无菌外植体建立的关键，是植物组织培养成功的最基本的重要前提和根本保证。不同的消毒方法、不同外植体类型对植物组织培养的影响不同，应根据灭菌外植体污染少、存活率高、易启动原则选取最佳外植体和消毒方法[2]。

不同的外植体对消毒药剂的需求不同。一般情况下，消毒药剂浓度太低，时间太短，不利于污染的控制；消毒药剂浓度太高，时间太长，会破坏外植体的细胞，由于细胞对自身的保护，细胞就不断地产生大量次生物质，从而引起细胞毒害，产生褐化甚至死亡，导致外植体的存活率下降[3]。外植体消毒能成功地降低污染，但由于消毒剂的穿透力和杀伤力也会对外植体造成损伤，影响外植体的再生及诱导愈伤组织[4]。在本实验中，土田七茎尖采用75%酒精30 s，0.1% HgCl2消毒15 min消毒效果最佳；叶片采用75%酒精10 s，0.1% HgCl2消毒6 min消毒效果最佳；根茎采用75%酒精30 s，0.1% HgCl2消毒30 min，基本上能达到较好的消毒效果。土田七3种外植体对消毒药剂的表现出不同的需求，可能的原因是：茎尖外植体有叶鞘包裹，感染杂菌的几率低受杂菌的污染较少，加之剥除叶鞘后的茎尖外表较光滑，因此较易消毒，污染率低；而外表的包片保护着茎尖生长点不直接受到消毒剂的伤害，故死亡率也较低。叶片生长于地面，带菌较少且表面光滑，较容易消毒，故消毒时间短，污染率也相对小。但叶片组织较薄，易受到消毒剂的伤害，从而引起细胞毒害，产生褐化甚至死亡，导致外植体的存活率下降。根茎生长在地下土壤中，带有的杂菌较多，而且表面不太光滑，故灭菌效果较差。然而，根茎外植体体积较大，不易对细胞组织造成伤害，故对消毒剂的耐受能力强。因此，外植体消毒时，要掌握好各个指标的平衡关系，尽量减少因消毒产生的对外植体的伤害，以免使外植体消毒后在培养过程中启动慢，或者不启动[5]。

植物种类不同，其无性繁殖的能力也不一样，同一种植物不同的组织和器官其再生能力也有很大的差异[6]。采用筛选出的最佳消毒方式，在相同培养条件下，土田七不同类型的外植体芽诱导率不同。从实验结果看，土田七茎尖材料的芽发生时间最早，芽诱导率明显高于根茎材料；叶片材料在培养40天后才有少量的外植体产生愈伤组织。3种外植体虽然携带着土田七相同的全套基因，但其组织培养结果不一样，这可能是与植物激素的分布有关，因植物体内内源激素分布不均，导致了基因表达不一致[3]。叶片培养需要较长的时间，愈伤组织萌动晚，而且叶片诱导的愈伤组织还需要较长的增殖分化时间，故叶片作为土田七组培外植体材料并不理想。根茎作为外植体，消毒时间长，污染率高，且芽发生较晚。茎尖作为外植体，无需经过愈伤组织可以直接获得芽，发生时间短，且诱导的芽数多，因此更容易满足短时间大量增殖组培苗和获得优质组培苗的目的。因此，土田七的组织培养外植体材料以茎尖为最佳。

本试验通过研究筛选出土田七组织培养适宜的外植体及其灭菌方法，为土田七组培快繁技术的建立打下了基础，对今后土田七的工厂化育苗以及资源的保持和可持续利用有着重要的意义。

[1] 高江云，夏永梅，黄加元，等. 中国姜科花卉[M]. 北京：科学技术出版社，2006：107.

[2] 刘进平，吴繁花. 木薯外植体表面消毒和启动培养的研究[J]. 广西热带农业，2004，94(5)：1-3.

[3] 汪灵丹，张日清，金晓玲. 外植体的选择和消毒对大叶榉组织培养的影响[J]. 湖南林业科技，2008，35(2)：21-23.

[4] 姚娜，赖志强. 象草腋芽外植体消毒方法的筛选[J]. 基因组学与应用生物学，2010，29(5)：21-23.

[5] 唐军荣，高柱，刘腾云，等. 红花山玉兰组织培养外植体的选择及其消毒方法[J]. 贵州农业科学，2014，42(11)：42-45.

[6] 谭文澄，戴策刚.观赏植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社，1991：85.

Study on Sterilization Technology of Explant of Wild Zingiberaceac PlantStahlianthusinvolucratus

Pan Mei，Fu Ruikan，Huang Sai，Qi Huasha﹡，Wang Jingfei，Lü Deren
(Tropical Horticulture Research Institute of Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou 571100，China)

In order to select appropriate explants type and disinfection methods ofStahlianthusinvolucratusin tissue culture and provide technical support for its asexual propagation，the stem tip，spire and rootstock were used as the explants. The best sterilization method of the explants were studied by using 75% alcohol and 0.1% HgCl2. The results showed that the disinfection of stem tip was relatively easy，followed by the spire，the rootstock was more difficult. Sterilizing the stem tip with 75% alcohol 30 s+ 0.1% HgCl215 min and sterilizing the spire with 75% alcohol 10 s+ 0.1% HgCl25 min were good and sterilizing the rootstock with 75% alcohol 30 s+ 0.1% HgCl230 min was better.

Stahlianthusinvolucratus；explant；sterilization

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.03.006

2016-10-18

海南省科研院所技术开发研究专项—海南姜科花卉植物收集与离体繁殖技术研究(KYYS-2015-14)。

潘梅(1962—)，女，高级园艺师，研究方向：植物组织培养研究与开发利用。E-mail：panmei200@sina.com

*通讯作者： 黄赛(1975—)，女，园艺师，研究方向：植物组织培养研究与开发利用。E-mail：huangsai512@163.com

S685；Q813.1

A

1006-9690(2017)03-0023-04