茶多酚对过氧化氢损伤PC12细胞活性氧簇的影响

邓凤君 肖 凌 杨吟宇 李新才*

（益阳医学高等专科学校药学系，湖南 益阳 413000）

茶多酚（Tea Polyphenols，TP）是一种抗氧化剂，源自于绿茶，是绿茶中最主要活性成分，有显著的抗氧化、抗炎等作用。能抑制与自由基有关的酶，抑制氧化酶系，如抑制细胞色素P2450环氧酶、氧化酶黄嘌呤氧化酶系（XO）等。TP亦能高效清除自由基，通过直接作用于自由基、再生或保护体内高效抗氧化剂、络合诱导氧化的过渡金属离子，产生显著的抗氧化作用[1-2]。本研究采用H2O2诱导PC12细胞损伤作为受损神经细胞体外模型，从TP对细胞活性氧簇的影响等方面研究了TP对H2O2诱导的PC12细胞损伤的作用。通过该研究，希望为TP应用于神经损伤性疾病提供可靠实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂与仪器：高糖DMEM培养基（GIBCO公司，USA），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物公司）。噻唑蓝（MTT，Sigma-Aldrich，USA），二甲基亚砜（DMSO，UNI-CHEM公司）；TP（质量分数98%，江西绿康天然产物有限责任公司），过氧化氢（H2O2，汕头光华化学厂），NO试剂盒（南京建成），iNOS试剂盒（南京建成），超氧自由基试剂盒（O·2-，南京建成），羟自由基试剂盒（·OH，南京建成）。超声波清洗器（中国华南超声波设备厂），离心机（TGL-16aR，上海安亭科学仪器厂），酶标仪（Model 680，Bio-RAD，USA），倒置相差显微镜（XDS-1B，Olympus，日本），752型紫外分光光度计（上海第二分析仪器厂）。PC12细胞购自中国科学上海细胞生物学研究所细胞库，源于大鼠肾上腺嗜铬细胞。

1.1.2 溶液配制：TP：称取适量，用无血清的DMEM配置成一定浓度的母液，过滤除菌后用无血清的DMEM稀释成所需浓度，现用现配。H2O2：取适量，过滤除菌，避光贮存4 ℃，临用前用无血清的DMEM配置成所需浓度。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理：PC12细胞种植于50 mL培养瓶中（2×105/mL），DMEM高糖培养基（含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素），置37 ℃、5% CO2的恒温培养箱内常规培养，每24 h换培养液1次，每48 h约80%满瓶时传代[3]。取对数生长期PC12细胞，以每孔2×105/mL分别接种在96孔板（MTT实验）或6孔板中（O·2-、·OH、NO、iNOS的测定实验），于37 ℃、5% CO2培养箱中进行孵育，24 h内细胞达到80%～90%融合后，同步化细胞（即用含体积分数0.01%胎牛血清的DMEM孵育细胞24 h）。TP（终浓度分别为5、10、20 μmol/L）预孵育细胞1 h，加入H2O2（终浓度500 μmol/L）共同培养2 h。

1.2.2 MTT实验建立H2O2损伤PC12细胞模型：PC12细胞损伤模型用MTT实验确立[4]。取对数生长期细胞接种在96孔板（每孔2×105/mL），如“1.2.1细胞培养和处理”所述接种、孵育、同步化。设7个组，空白对照组与6个不同浓度H2O2组。空白对照组加入等量的培养液使H2O2终浓度0 μmol/L，其余6组分别加入H2O2（终浓度100～600 μmol/L）孵育2 h，空白对照组与各个H2O2浓度组及均设6个平行孔。吸弃培养液，加终浓度1 g/L MTT液，孵育4 h后吸弃上清，每孔加DMSO 150 µL，平板震荡仪轻轻震荡5 min，用酶标仪测定吸光度值（570 nm）。细胞存活率按公式计算：细胞存活率=A570（处理组）/A570（对照组）×100%。

表2 TP对H2O2诱导的PC12细胞O·2-、·OH水平的影响（±s）

表2 TP对H2O2诱导的PC12细胞O·2-、·OH水平的影响（±s）

注：#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs.空白对照组；**P ＜ 0.01 vs. H2O2模型组

组别 n(平行孔数) 抑制O·2-活性(U/L) 产生·OH能力(U/mL)空白对照组 3 267.22±15.38 903.23±2.21 H2O2组 3 -12.12±1.24## 1254.45±2.32##TP 5 μmol/L + H2O2组 3 39.62±8.25** 1034.39±15.23**TP 10 μmol/L + H2O2组 3 183.81±10.27** 954.87±18.43**TP 20 μmol/L + H2O2组 3 202.26±15.71** 917.39±1.64**F 168.176 490.945 P 0.000 0.000

表3 TP对H2O2诱导的PC12细胞iNOS活性、NO水平的影响（±s）

表3 TP对H2O2诱导的PC12细胞iNOS活性、NO水平的影响（±s）

注：##P＜0.01 vs. 空白对照组；**P＜0.01 vs. H2O2模型组

组别 n(平行孔数) iNOS 活性(U/mL) NO水平(μmol/L)空白对照组 3 5.39 ±0.07 389.55±74.83 H2O2模型组 3 33.44±2.27## 1747.36±21.42##TP 5 μmol/L + H2O2组 3 20.28±0.31** 1184.51±22.45**TP 10 μmol/L + H2O2组 3 19.27±0.21** 919.37±22.45**TP 20 μmol/L + H2O2组 3 15.27±0.63** 688.63±73.12**F 223.127 271.059 P 0.000 0.000

1.2.3 测定受损PC12细胞O·2-活性：取对数生长期细胞，接种在6孔板（每孔2×105/mL），如“1.2.1细胞培养和处理”所述接种、孵育、同步化。分为5组，空白对照组（加入等量的培养液），H2O2模型组（仅加入终浓度500 μmol/L H2O2），3种不同浓度的TP组（加入TP使终浓度5、10、20 μmol/L预孵1 h，再加终浓度500 μmol/L H2O2共同培养2 h），每组均设3个平行孔。药物处理完毕后弃培养液，0.125% 胰蛋白酶消化细胞使之脱壁，每样本细胞数为（1～5）×106，义，400～600 μmol/L剂量组降低细胞活力显著，且具有统计学意义（P＜0.01，表1）。1500 rpm（离心半径6 cm，离心力151 xg），离心5 min，收集细胞至0.5 mL裂解缓冲液（0.1 mol/L PBS 中含0.5% Triton X-100，pH 7.0），用超声粉碎仪震荡处理，破碎细胞，直至显微镜下观大部分细胞已破碎，4 ℃，1200 rpm（离心半径6 cm，离心力97 xg），20 min离心。取细胞破碎后上清，按照试剂盒说明进行测试。

图1 H2O2诱导PC12细胞形态学（×100）

1.2.4 受损PC12细胞·OH活性的测定：依据1.2.3法，收集细胞破碎后的上清液，采用Fenton法，按照试剂盒说明进行测试。

1.2.5 受损PC12细胞NO含量的测定：按照1.2.3法处理细胞。即，细胞接种在6孔板（每孔2×105/mL），如“1.2.1细胞培养和处理”所述接种、孵育、同步化。分为5组，空白对照组（加入等量的培养液），H2O2模型组（仅加入终浓度500 μmol/L H2O2），3种不同浓度的TP组（加入TP使终浓度5、10、20 μmol/L预孵1 h，再加终浓度500 μmol/L H2O2共同培养2 h），每组均设3个平行孔。药物处理完毕后，收集细胞培养液，采用硝酸还原酶法，按照试剂盒说明进行测试。

1.2.6 受损PC12细胞iNOS活性的测定：依据1.2.3法收集细胞破碎后的上清液，根据试剂盒说明进行测试。

1.2.7 统计学方法：所有实验数据以（±s）表示。SPSS16.0软件做统计处理，数据分析采用单因素方差分析 ，各组之间多重比较采用LSD或Dunnett's多重比较法。采用LSD多重比较法分析O·2-、iNOS与NO活性；Dunnett T3多重比较法分析·OH活性。P＜0.05表示有统计学意义。

表1 H2O2诱导PC12细胞活力改变（±s）

表1 H2O2诱导PC12细胞活力改变（±s）

注：**P ＜ 0.01 vs. 0 μmol/L组（空白对照组）

组别 n(平行孔数) 细胞存活率(%)0 μmol/L 组(空白对照组) 6 100.0±0.0 100 μmol/L组 6 88.8±9.6 200 μmol/L组 6 101.3±6.6 300 μmol/L组 6 75.7±21.2 400 μmol/L组 6 48.7±8.1**500 μmol/L组 6 47.0±3.8**600 μmol/L组 6 44.3±4.0**F 39.80 P 0.000

2.2 TP对H2O2诱导的PC12细胞内O·2-、·OH、iNOS与细胞外NO水平的影响：为证实TP对H2O2诱导的PC12细胞细胞活性氧簇的作用，我们检测了细胞内O·2-、·OH、iNOS与细胞外NO水平。H2O2诱导细胞损伤后，细胞内抑制O·2-活性能力下降，产生·OH能力增加，与空白对照组比较有显著统计学差异（P＜0.01，表2）。TP预孵育1 h，5、10、

2 结 果

2.1 H2O2对PC12细胞损伤作用：由图1可见，空白对照组PC12细胞分布均匀且体积饱满，各损伤组细胞体积明显缩小，胞体萎缩，突起消失，细胞间隙增大，表面光滑。损伤程度以600 μmol/L最严重。数据统计结果亦显示，H2O2孵育PC12细胞2 h，细胞受损显著，与空白对照组相比，100～300 μmol/L剂量组细胞活力降低，但是没有统计学意20 μmol/L 3个TP浓度组细胞内显著抑制O·2-活性，减少·OH产生，与H2O2模型组比较有显著统计学差异（P＜0.01，表2）。H2O2诱导细胞损伤后，细胞内iNOS活性与细胞外NO水平明显上升，与空白对照组比较有显著统计学差异（P＜0.01，表2）。TP预孵育1 h，5、10、20 μmol/L 3个TP浓度组细胞内iNOS活性与细胞外NO水平下降，与H2O2组比较有显著统计学差异（P＜0.01，表3）。说明TP能有效拮抗H2O2导致的氧自由基活性的增加。

3 讨 论

TP是源自茶叶的高效天然的抗氧化剂，能清除自由基，具有抗衰老、提高免疫力、防癌、抗炎等一系列优异功能。TP易过血脑屏障，清除自由基[5]。因此我们假定它也许能保护神经细胞，治疗神经细胞损伤性疾病。

PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，常常被广泛用来研究帕金森病、阿尔茨海默病等多种神经系统疾病[6]。H2O2是最主要最稳定的ROS家族成员，亦能够穿透并且损伤生物膜、线粒体，所以H2O2常常作为毒性物质来模拟氧化应激体外模型[7]。因而，本研究使用H2O2诱导的PC12细胞损伤作为神经损伤体外模型来评价TP对受损神经细胞活性氧簇的影响。

有氧代谢过程中机体会产生ROS，主要包括H2O2、O·2-、·OH和NO等。当机体受到刺激性因素作用而处于氧化应激状态时，细胞内活性氧水平就会升高，损害机体引起多种途径的细胞功能紊乱。O·2-自由基是形成单线态氧和羟自由基（·OH）的前体之一，并能够间接启动脂质过氧化损伤，破坏生物大分子如DNA、酶等。羟自由基（·OH）在体内的形成主要是由过氧化物负离子和过氧化氢（H2O2）反应生成，羟自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物[8]。活性氧簇的另一主要成员是NO，过量的NO参与许多病理损伤过程，对机体具有毒性作用。而iNOS能诱导产生NO，iNOS生理情况基本不存在，当存在感染、缺血、损伤等诱导因素时，刺激iNOS-mRNA表达，持续大量生成NO，使细胞内Ca2+浓度增加，成为强自由基，破坏呼吸链，耗竭ATP，损伤DNA，导致细胞凋亡[10]。实验证实，当神经组织处于创伤缺血等条件下，iNOS·NO通路激活，使神经组织局部NO增多，参与神经细胞的损伤过程[9]。

本研究结果显示，PC12细胞经H2O2诱导损伤后，细胞内产生·OH能力迅速增加，抑制O·2-活性能力急剧下降，采用TP预孵育1 h，各TP浓度组细胞内产生·OH能力急剧减少，抑制O·2-活性能力显著增加。同时细胞经H2O2诱导损伤后，细胞iNOS与NO水平急剧上升，但TP预孵育1 h，各TP浓度组细胞iNOS与NO水平下降。说明TP能有效拮抗H2O2导致的氧自由基活性的增加，抑制iNOS·NO通路的激活。

综上所述，TP能降低受损P12细胞内活性氧簇水平，结合本课题的其他研究结果[10]，说明TP对受损神经细胞有一定的保护作用，其可能的机制之一是TP能降低受损P12细胞内活性氧簇水平。但是尚需进一步研究TP抑制H2O2诱导PC12细胞损伤的分子信号机制。

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