麻醉期间低体温对发育期大鼠学习记忆能力及海马凋亡率的影响

刘文博 熊兴龙 杨剑 禹文峰 欧炜 吕洁

贵州医科大学1麻醉学院，2分子生物学教研室（贵阳 550004）

全身麻醉由于各种因素对体温调节系统影响，导致患者外周血管扩张和中心体温下降发生低体温，是围术期最常见的并发症之一。有文献报道，50%～70%的手术患者出现低体温，在实施外科手术的患者中，小儿更易发生低体温。围术期意外的低体温将给机体带来不良后果，尤其是对中枢神经系统的不利影响不能忽视：长时间的冷暴露可以引起大鼠学习记忆损伤［1］，并可能导致海马区域的功能损害［2］。机体受到寒冷损伤时可由氧化损伤导致其进一步发展：诱导脑水肿，继发损伤及细胞凋亡［3］；国外曾有文献报道低温可能诱导细胞凋亡［4］，国内也有中低温体外循环可诱导大鼠海马CA1区神经元凋亡的报道。然而目前国内外并无低体温是否造成发育高峰期海马凋亡并引起远期记忆障碍的相关研究，因此本研究选取7 d龄新生大鼠，建立全麻诱导的低体温模型，通过动物行为学测试并检测海马组织凋亡率，拟探讨麻醉期间低体温状态对发育期大鼠远期学习记忆能力及海马组织凋亡率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 7日龄SD新生大鼠（贵州医科大学动物实验中心提供）；丙泊酚（批号：16KK5643，北京费森尤斯卡比医药有限公司）；DMEM（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；AnexinFITC/PI双染试剂盒（BD公司）；流式细胞仪（BECTON DICKLNSON公司）；

1.2 方法

1.2.1 动物及分组 出生7 d的SD新生大鼠40只，12～16 g，雌雄各半，按随机数字表法分为四组（n=10）：对照组（C组）、麻醉保温组（A组）、麻醉低温组（AH组）、物理低温组（H组）。C组腹腔注射0.1 mL生理盐水并配备加热垫保持直肠温度在38～39℃；A组以25 mg/kg腹腔注射异丙酚0.1 mL，每20 min追加初始剂量的一半，麻醉2 h，同方法保持直肠温度在38～39℃；AH组麻醉方式及时间与A组相同，大鼠在麻醉过程中不保温，控制室温条件为23℃，允许体温自然地下降；H组大鼠腹腔注射0.1 mL生理盐水，物理降温方式与AH组相同。麻醉过程中持续吸氧，观察大鼠呼吸、皮肤颜色，大鼠腹部固定带状婴儿脉搏血氧饱和度探头，持续监测SpO2（并维持SpO2在95%～99%），从麻醉开始即刻至麻醉结束时，每20 min记录一次，标记时间点为T0～T6，防止大鼠脑缺氧。间断监测大鼠体温变化，每20 min记录1次，标记时间点为T0～T6。

1.2.2 行为学测试 每组随机选取5只大鼠饲养至30 d采用Morris水迷宫检测实验动物的空间学习记忆能力。Morris水迷宫测试程序主要包括定位航行实验和空间探索实验两个部分，历时6 d。根据池壁上标记的四个入水点，将水池分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限，第Ⅳ象限处存在隐匿平台。行定位航行实验时，大鼠每天分别从各象限入水点处入水，由图像采集及处理系统记录小鼠航行轨迹，令实验动物在水迷宫内自由游泳2 min寻找隐匿平台（1.5 cm），并记录找到平台所需时间（逃避潜伏期），若120 s内未找到平台记录为120 s，实验连续进行5 d，每天训练4次。第6天行空间探索实验，拆掉水下平台，同样令动物自由游泳2 min，记录2 min内穿越平台次数及原平台象限逗留时间。测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，水温保持在（25.0±1.0）℃，以排除干扰因素。

1.2.3 流式细胞术检测海马组织凋亡率 分别于大鼠麻醉清醒后即刻和Morris水迷宫测试结束时，每组随机选取5只大鼠处死，于冰上断头取大脑海马组织。置于冰冻PBS中，剪碎，清洗3次。将处理后的组织移入15 mL离心管中，加入0.25%胰酶1 mL，置于37℃恒温水浴箱中消化30 min。加入DMEM（含10%胎牛血清）1 mL终止消化。经300目滤网过滤后，转入15 mL离心管中，1 000 r/min，离心5 min，弃上清加入PBS 2 mL摇匀，再次同样转速离心5 min，弃上清加入PBS 1 mL摇匀。将制备好的单细胞悬液浓度调整为1×106个/mL，取1 mL细胞，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入400 mL 1×Binding Buffer液中，加入5 mL Annexin V⁃FITC 和 5 mL Propidium Iodide，混匀，避光孵育15 min。1 h内上机检测，所用试剂盒为Anexin⁃FITC/PI双染试剂盒，流式细胞仪为美国BECTON DICKLNSON公司生产。所得数据采用Flowjo 10进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，不同时点比较采用重复测量设计的方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 四组大鼠SpO2均在正常范围，差异无统计学意义（表1）。麻醉期间，分别与C、A组比较，AH、H组大鼠体温明显下降（P＜0.05）（图1）。

表1 4组大鼠SpO2比较Tab.1 Comparison of SpO2in 4 groups（n=10）±s，%

表1 4组大鼠SpO2比较Tab.1 Comparison of SpO2in 4 groups（n=10）±s，%

组别C组A组AH组H组T0 96.2±1.4 95.8±2.5 96.4±2.7 96.0±2.1 T1 96.2±1.3 94.2±1.9 95.0±1.8 96.2±1.6 T2 97.2±1.3 96.4±0.8 96.6±1.8 96.6±2.0 T3 95.8±1.0 96.2±1.3 95.8±1.0 96.0±2.4 T4 97.0±2.1 96.0±1.5 95.8±2.2 97.4±1.8 T5 97.0±0.7 96.0±1.2 95.4±1.5 97.0±2.0 T6 97.2±1.0 96.8±1.3 97.6±1.1 96.8±0.8

图1 四组大鼠体温比较Fig.1 Comparison of temperature in 4 groups

2.2 动物行为学测试比较 各组间逃避潜伏期差异无统计学意义（表2）；空间探索试验中，四组大鼠穿越平台次数及原平台象限逗留时间比较差异无统计学意义（表3）。

2.3 海马组织凋亡率比较 由散点图可见，凋亡率为Q2象限和Q3象限细胞数总和所占百分比。在7日龄大鼠中，分别与C、A组比较，AH、H组凋亡率增高（P＜ 0.05）（图2）。在36日龄大鼠中，四组凋亡率比较差异无统计学意义（图3）。

表2 4组大鼠逃避潜伏期的比较Tab.2 Comparison of escape latency in 4 groups（n=5）±s，s

表2 4组大鼠逃避潜伏期的比较Tab.2 Comparison of escape latency in 4 groups（n=5）±s，s

分组C组A组AH组H组第1天72.3±23.1 93.7±22.2 83.8±19.7 70.8±22.1第2天46.8±23.2 49.0±21.4 44.5±18.8 43.1±24.3第3天44.6±21.6 46.4±23.3 41.2±21.8 48.0±19.6第4天23.6±13.3 22.5±10.1 26.0±10.2 22.0±7.8第5天17.4±13.5 18.8±5.8 21.0±11.2 22.9±3.5

表3 4组大鼠穿越平台次数及原平台象限逗留时间比较Tab.3 Comparison of the times of crossing the platform and the time of staying original platform quadrant in 4 groups（n=5）±s

表3 4组大鼠穿越平台次数及原平台象限逗留时间比较Tab.3 Comparison of the times of crossing the platform and the time of staying original platform quadrant in 4 groups（n=5）±s

组别C组A组AH组H组穿越平台次数7.6±3.9 7.2±4.4 8.6±3.3 6.4±4.2原平台象限逗留时间（s）55.4±21.5 44.4±13.3 42.6±6.6 40.7±14.3

图2 7日龄四组大鼠凋亡率比较Fig.2 Comparison of apoptotic rate of 7⁃day⁃old rats in four groups

3 讨论

图3 36日龄四组大鼠凋亡率比较Fig.3 Comparison of apoptotic rate of 36⁃day⁃old rats in four groups

海马体（hippocampus）位于大脑丘脑和内侧颞叶之间，属于边缘系统的一部分，其功能与学习记忆、情绪反应等密切相关。海马受损会导致学习记忆障碍。流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸（PS）迁移到膜外，可利用AnnexinV对PS的高度亲和力将凋亡细胞标记出来。但坏死细胞由于PS暴露于细胞外也呈An⁃nexinV阳性，因此需要采用PI这一参数将坏死细胞区分开来。坏死细胞PI强染色，而凋亡细胞染色较弱。AnnexinV/PI双参数法能够检测早期细胞凋亡，可以正确区分凋亡和坏死，多数文献推荐其作为流式细胞术检测凋亡的方法［5］。因此本研究采用AnnexinV/PI双参数法检测低温对海马组织凋亡率的影响。

根据现有文献［6］并结合初步实验结果，当丙泊酚剂量为25 mg/kg时，即可达到麻醉效果，使新生大鼠翻正反射消失，所以笔者选择该剂量进行麻醉，持续时间为2 h。大鼠是晚成性哺乳动物，新生大鼠体温调节能力微弱，将幼体单独隔离后其体温会因环境温度的变化而变化，直至达到接近环境温度的水平［7］。因此笔者通过调控实验室环境温度为23℃，在不保温的条件下，使新生大鼠体温随环境温度而下降，结合预实验并参照WHITTINGTON等［8］的研究，将体温最低降至25℃左右。

由研究结果可以看出：7 d龄大鼠中，处于低体温状态的两组海马组织凋亡率均明显增高。而通过对体温相近的两组间比较，发现海马组织凋亡率含量无明显差异，提示低体温可能是造成凋亡率增高的主要原因。其机制可能与多种因素有关，已有文献报道在寒冷应激状态下Akt（蛋白激酶B）⁃ERK信号通路表达下调［9］，Akt及ERK与细胞的凋亡有着密切的关系，其下调可能是参与导致凋亡率增高的原因之一［10］。在低体温条件下，由于大鼠海马ATP含量下降，受其调控的cAMP/PKA通路表达的下调同样可诱导细胞凋亡的发生。低温可降低神经细胞间广泛存在的缝隙连接通讯功能，影响了营养物质在细胞间的传递，因此，同样也可造成神经组织的损害［11］。低温也可诱导海马组织中Tau蛋白过度磷酸化，产生细胞毒性并介导神经元凋亡［12］。另有研究表明麻醉期间低体温可引起大鼠神经细胞产生胰岛素抵抗，降低脑内胰岛素对凋亡的抑制作用［13-14］。低体温状态下凋亡率增高可能还与冷环境刺激引起细胞内Bax蛋白相关基因表达高于Bcl⁃2相关基因表达有关［15］。

为了测试低体温是否对各组间的远期学习记忆能力同样造成影响，我们采用Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力，并同样检测海马组织凋亡率。结果表明在36日龄大鼠水迷宫测试结束时，各组行为学测试结果及海马组织凋亡率均无统计学意义，这可能是由于短时间内低体温对神经系统的损害是可逆的，其造成的影响会随体温的恢复而逐渐消失，国外亦有与本研究结果一致的报道［16］。

综上所述，在本研究低体温范围内，麻醉期间体温降至25℃时可短期诱导新生大鼠海马组织凋亡率增高，而对其远期学习记忆能力无明显影响。本研究为婴幼儿临床麻醉中需要注意加强保温措施，以预防低体温造成的中枢神经系统损害，提供了一定的实验参考数据。但本实验未进一步研究其分子机制且样本量较少，以及由于本实验中低温处理的时间略短而未能体现低体温造成的远期危害，这些都是本研究的不足之处。为进一步完善本研究，后续笔者将针对麻醉期间低体温大鼠进行凋亡相关蛋白等机制的探讨。

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