手霉素通过上调P53诱导22Rv1前列腺癌细胞凋亡

李劲高 陈景 佘妙容中山大学孙逸仙纪念医院肾内科（广州500）；广东省人民医院，广东省医学科学院 医学研究部，血液科（广州50080）

在美国，前列腺癌（prostate cancer，PC）是男性最常见的恶性肿瘤［1-2］，中国男性PC的发病率和病死率低［3-4］，但发病率随着年龄的增长而增加，在70岁以上的中国男性泌尿生殖系肿瘤排第一位，前列腺癌已成为严重影响我国男性健康的恶性肿瘤，目前的治疗手段主要包括手术、放疗、激素治疗、化疗和联合治疗。然而，PC细胞对化疗和放疗治疗均不敏感，因此，迫切需要新的有效治疗方法。靶向异常信号转导系统诱导细胞凋亡是杀伤恶性肿瘤细胞的重要方法之一。Ras信号通路是肿瘤细胞重要的生存通路，很多研究发现肿瘤细胞存在Ras原癌基因突变，譬如前列腺癌细胞［5］。法尼酰基转移酶抑制剂（Farnesyltransferase inhibitors，FTIs）能通过选择性抑制法尼基蛋白转移酶抑制Ras信号通路，手霉素，则是在链丝菌培养液中发现的FTIs。笔者前期的研究发现手霉素能诱导白血病和甲状腺癌细胞发生凋亡［6-9］，还能促使肿瘤细胞发生DNA损伤，然而它在抗PC细胞的作用及机制仍不清楚。本研究以人前列腺癌22Rv1细胞为研究对象，旨在探讨手霉素对前列腺癌细胞的杀伤作用及其机制，以期为前列腺癌的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 细胞系和试剂 22Rv1细胞系购自美国Type Culture Collection，在10%小牛血清的RPMI1640培养液中生长。本研究实验均取对数生长期的22Rv1细胞。手霉素，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）和二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）购自Sigma（St Louis，MO）公司。RPMI1640组织培养液购自Gibco有限公司。胎牛血清购自HyClone（Logan，UT，USA）公司，抗⁃caspase⁃3抗体和抗⁃P53抗体、抗H2AX抗体购自Cell Signaling Technol⁃ogy（Danvers，MA，USA）公司，Annexin V结合缓冲液和 annexin V 购自 BD Biosciences（San Jose，CA，USA）公司。用组织培养级的DMSO溶解手霉素配制成储存液，放-20℃冰箱保存备用，实验时将手霉素稀释成所需的浓度，并保证DMSO在细胞培养液中的浓度不超过0.001。

1.2 MTT测定法检测细胞的活性 将对数生长期的22Rv1细胞离心收集，以5 000个细胞/孔为起始密度种植到96孔板过夜，加入不同浓度的手霉素（每个浓度至少设定3个复孔）处理48 h后，每孔加入MTT试剂（3 mg/mL）20 μL，在培养箱孵育4 h，之后以1 500 r/min离心15 min，弃去上清，每孔加入200 μL DMSO溶解细胞团，最后在酶标仪上测定OD值，并做好记录。

1.3 Annexin v/PI流式细胞术测定 将22Rv1细胞接种到小培养皿中过夜，加入手霉素处理24 h后离心收集细胞团。染色时，细胞用预冷的PBS溶液洗2次，重悬在1×结合缓冲液里，100 μL溶液移到5 mL 培养管，加入 5 μL Annexin V⁃FITC和5 μL PI，轻轻摇动细胞室温避光培养 15 min，加入400 μL结合缓冲液在流式细胞仪上进行分析。做3次独立实验。

1.4 细胞裂解 离心收集经手霉素处理16 h后的细胞放冰上，冷PBS洗涤细胞后加入裂解液充分裂解，4℃、20 630×g离心取上清液即为实验所需蛋白液，最后测蛋白浓度。

SDS⁃PAGE和免疫印迹 将提取的蛋白上样，SDS电泳，随后冰水中电转移到PVF膜，阻断非特异蛋白，一抗孵育过夜后洗膜3次，二抗孵育60 min，洗膜3次，加入ECL溶液孵育1 min，用Kodak X⁃AR胶卷记录产生的荧光图像。实验重复3次。

1.5 统计学方法 用SPSS 16.0统计软件进行分析，以±s表示数据，各实验组间的比较均采用单因素方差分析，P＜0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 手霉素减少22Rv1前列腺癌细胞活性 不同浓度的手霉素（0～32 μmol/L）处理22Rv1细胞48 h，MTT方法检测细胞活性。如图1所示，随着手霉素浓度的增加，22Rv1细胞的活性逐渐减少，呈浓度依赖性。

图1 手霉素减少22Rv1前列腺癌细胞的活性Fig.1 Cytotoxic effect of manumycin against 22Rv1 prostate cancer cell line

2.2 手霉素诱导22Rv1前列腺癌细胞凋亡 如图2所示，和DMSO处理的对照组相比，手霉素处理24 h后，早期凋亡率（%）（31.32±1.23vs.0.91±0.01）和晚期凋亡细胞率（%）（27.23±0.94vs.0.29±0.03）均明显增加（P＜0.05）。

图2 手霉素诱导22Rv1前列腺癌细胞凋亡Fig.2 Manumycin induced apoptosis in 22Rv1 prostate cancer cell line

2.3 手霉素诱导22Rv1前列腺癌细胞Caspase3激活 培养的细胞分为2个治疗组：DMSO对照组和32 μmol/L手霉素组，处理16 h。结果发现手霉素引起22Rv1前列腺癌细胞Caspase⁃3激活，其中包括pro⁃Caspase⁃3的减少和裂解激活Caspase⁃3的出现。见图3。

2.4 手霉素诱导22Rv1前列腺癌细胞H2A.X磷酸化 如图4所示，磷酸化H2AX的表达水平在用手霉素处理16 h后比对照组明显增加，提示手霉素可以诱导DNA损伤。为进一步明确H2A.X磷酸化和凋亡的上下游关系，应用Caspase⁃9和全Caspase抑制剂对H2AX的影响，结果提示Caspase⁃9和全Caspase抑制剂可部分抑制H2AX的磷酸化，提示Caspase⁃9特异和全capspase抑制剂阻断DNA损害，DNA损伤需要Caspase⁃9和全Caspase的激活，但没有发生完全的凋亡。手霉素上调22Rv1前列腺癌细胞P53的表达如图5所示，和DMSO对照组相比，手霉素上调P53的表达。

图3 手霉素诱导22Rv1前列腺癌细胞Caspase⁃3激活Fig.3 Manumycin induced activation of caspase⁃3 in 22Rv1 prostate cancer cell line

图4 手霉素介导22Rv1细胞DNA损害Fig.4 Manumycin⁃mediated DNA damage in22Rv1 cells

图5 手霉素上调22Rv1前列腺癌细胞P53的表达Fig.5 Manumycin up⁃regulated the expression of P53 in 22Rv1 cells

3 讨论

这个研究提示手霉素通过上调22Rv1细胞的P53表达、增加H2AX磷酸化、诱导capsase3激活有效诱导前列腺癌22Rv1细胞凋亡。

FTIs用于治疗实体瘤和恶性血液病，我们既往的研究发现手霉素诱导甲状腺癌和白血病细胞凋亡。我们的结果提示手霉素通过增加22Rv1细胞的早期和晚期凋亡，从而减低22Rv1前列腺癌细胞活性，这些发现证实和扩展了FTIs诱导慢性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞凋亡的结果［10-11］。很多癌症发现有凋亡途径的异常，而凋亡的缺失是前列腺癌的致癌原因之一，因此，很多常规的治疗着重于诱导凋亡。

凋亡通过抗凋亡和促凋亡效应分子调节，通过内源性和外源性信号通路介导。这些信号通路影响线粒体的膜电位，诱导Caspase⁃9激活，随后激活效应分子Caspase⁃3，激活Caspase⁃3导致细胞凋亡。本研究发现手霉素通过增加Caspase⁃3激活诱导22Rv1细胞凋亡。

化疗药物可通过诱导凋亡、DNA损害和细胞周期阻滞抑制肿瘤细胞生长。凋亡研究发现很多原癌和抑癌基因与调节凋亡有关。肿瘤抑制基因P53是一种被深入研究的决定性基因之一，它可以调节DNA的复制，激活依赖于P53的凋亡途径，通过DNA损害从而促进细胞周期阻滞和凋亡的转录因子，抑制肿瘤细胞的增殖，具有良好的抗肿瘤作用［12-13］。既往的研究发现凋亡诱导剂可造成肿瘤细胞依赖和非依赖于P53的凋亡。在人类至少50%的肿瘤P53可突变或失活而失去野生型的功能而导致肿瘤的发展［14］。在包括DNA损害在内的各种压力下P53通过转录因子激活［15］。对这种压力的反应，P53结合特异的DNA序列，最终驱动涉及细胞周期阻滞和凋亡的转录基因，激活P53杀伤肿瘤细胞［14-16］。我们的结果发现手霉素可以上调P53的表达，诱导蛋白质翻译后P53修饰而增加细胞内P53水平，诱导肿瘤细胞内P53表达从而诱导依赖于P53的凋亡，是一种有前景的治疗方案。

DNA损害常常被认为是细胞压力的原因，如药物或放射治疗结合到DNA直接诱导细胞压力。然而既往的研究提示DNA损害可以是细胞压力的结果。这双重的作用提示DNA损害在应激系统起重要的作用，通过正反馈发展和放大。本研究结果提示手霉素可以诱导DNA损害，但Caspase⁃9和全Caspase抑制剂可部分抑制H2A.X的磷酸化，提示Caspase⁃9特异性和全Caspase抑制剂阻断DNA损害，DNA损伤需要Caspase⁃9和全Caspase的激活。

终上所述，笔者发现手霉素可以通过上调P53的表达，增加H2AX磷酸化而诱导细胞凋亡。本研究阐明了手霉素有效治疗前列腺癌的机制，为治疗前列腺癌提供潜在的治疗方法。

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