封口方式对红曲产洛伐他汀的影响

齐文武，陈晓云，郑世茂，庞 欣

(北京东方红航天生物技术股份有限公司空间诱变研究中心，北京 101400)

红曲为药食两用的传统中药材，以大米为原料经固体发酵制得，被广泛应用于食品着色、酿酒以及中药等[1-4]。近年来，红曲霉的活性代谢产物洛伐他汀受到大家的广泛关注。1979年，日本学者Endo等[5]从红曲菌中分离出抑制羟甲戊二酰辅酶A还原酶活性更高的物质，后被称作洛伐他汀。随后，含有洛伐他汀的红曲被开发成降血脂和治疗心血管等疾病的新药[6-7]。目前，红曲霉发酵产洛伐他汀的生产工艺仍然以固态发酵更为有效[8-9]。微生物固态发酵远远不及液体发酵的工艺控制精准，虽然广大科研工作者对红曲固态发酵产洛伐他汀的影响因素已经有了一定的研究[10-11]，但仍然有限。影响红曲霉发酵的因素有养分组成、不同阶段的发酵温度、培养时间、通气量等。到目前为止，关于红曲发酵过程中的通气方式、通气量对发酵影响的研究不够深入，种子液培养基和固体培养基的封口方式如何影响红曲的次生代谢尚未见报道。本试验采用红曲霉固体发酵的方式，在发酵温度、前体物质、初始pH、接种量和培养基含水率相同的前提下[12]，研究在种子液及固体培养过程中，不同封口方式对发酵过程中及最终产物中洛伐他汀含量的影响，通过洛伐他汀含量的高低确定最适封口组合方式，进而优化红曲发酵的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 所用菌种为本公司制备保存的菌种。

1.1.2 试剂及培养基材料 色谱级甲醇、无水乙醇、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏和大米粉等。

1.1.3 仪器设备 Waters高效液相色谱仪、双光束紫外分光光度计、分析天平、医用离心机、高速粉碎机、超声波清洗机、水浴锅、各种型号标准筛等。

1.2 发酵方法

1.2.1 接种 将保藏菌种进行扩大培养，接种于种子液培养基，摇床培养72h后接种于固体培养基。

1.2.2 培养基配制 种子液培养基按照物料比例准确称量，混匀，分装，分别使用纱布、棉塞和试管膜进行封口，做好标记，121℃灭菌20min，冷却至常温后，备用。固体培养基按照物料比例准确称量，混匀，分装，分别使用纱布、棉塞和试管膜进行封口，做好标记，121℃灭菌30min，趁热打开培养基中的凝块，冷却至常温后，备用。

1.2.3 实验处理 采用纱布、棉塞和试管膜3种封口方式，进行正交试验(表1)。试验编号说明：XX表示固体培养基封口方式+种子液培养基封口方式。

表1 封口组合方式

1.2.4 发酵、烘干、粉碎 接种后的固体培养基经过高温发酵、低温发酵得到红曲。红曲经烘干、粉碎、过筛、混匀、取样检测。

1.3 红曲中洛伐他汀含量的测定

1.3.1 色谱参考条件 色谱柱：C18柱 150 mm×4.6 mm×5 μm；流动相：甲醇∶水∶磷酸=85∶15∶0.4(体积比)；波长237 nm；柱温25℃；

1.3.2 处理方法 样品全部过100目标准筛，称取0.1～0.2 g，置于8mL的离心管，精密加入4 mL 75%的乙醇溶液超声处理1 h，取出，离心处理10 min，吸取上清液1 mL，加入0.5 mL的氢氧化钠—乙醇溶液，摇匀，静置10 min，加入0.5mL的磷酸—乙醇溶液，摇匀，静置10 min后离心，取上清液5μL，检测。

称取内酯型洛伐他汀标准品，配制200g/mL的标准液。吸取标准液1 mL，加入0.5 mL的氢氧化钠—乙醇溶液，摇匀，静置10 min，加入0.5mL的磷酸—乙醇溶液，摇匀，静置10 min后离心，取上清液5μL，检测。

1.4 红曲中洛伐他汀含量、桔青霉素含量的测定

依据《GB/T 5009.222-2008》[14]测定。

1.5 统计学方法

采用SPSS软件对数据进行方差分析，P<0.05认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同封口组合方式下发酵红曲中洛伐他汀含量的变化

当红曲进入低温发酵阶段后，从第4天开始取样，每隔2d取样1次，直至发酵结束，检测不同处理方式随发酵时间红曲中洛伐他汀含量的变化，取样检测的结果见表2。高温发酵阶段(30～35℃)，菌丝快速生长，生物量逐渐积累到一定阶段后转入低温发酵。低温发酵阶段(20～25℃)，利于洛伐他汀的积累[12]，故从低温阶段开始取样。从洛伐他汀合成量来看，当固体培养基采用纱布封口，同时种子液培养基采用纱布或棉塞封口时，红曲中洛伐他汀含量的增长较快，洛伐他汀的产量最高；当固体培养基和种子液培养基均采用试管膜封口时，红曲中洛伐他汀增长较慢，洛伐他汀的含量最低。从不同处理方式对红曲产洛伐他汀的显著性分析(表3)可以看出，在0.05的显著性水平下，AA与AB这2种封口组合方式对红曲产洛伐他汀无显著性影响，但是与其余几种封口组合方式相比，这2种方式可显著提高发酵产物中的洛伐他汀含量，而且随着时间的推移效果更为显著。

表2 洛伐他汀合成量 单位：mg/g

表3 不同封口方式组合对红曲产洛伐他汀的影响

注：*显著性水平为0.05

2.2 桔青霉素的检测

9种不同封口组合方式下红曲的发酵过程中均未检测到桔青霉素[14]。桔青霉素是红曲发酵产物中重要的有害成分，说明这几种发酵方式均是安全可靠的。

3 结论

本试验旨在研究纱布、棉塞和试管膜这3种不同的封口组合方式对红曲产洛伐他汀含量的影响，结果发现，当固体培养基采用纱布封口，液体培养基采用纱布或棉塞封口时，红曲产洛伐他汀的含量最高且桔青霉素未检出。同时可以看出，在固体培养基封口固定的情况下，种子液培养基使用棉塞或纱布封口较试管膜封口得到的发酵产物中洛伐他汀的含量高；而种子液培养基使用棉塞和纱布封口得到的发酵产物中洛伐他汀的含量十分接近。整体看来，在种子液培养基封口方式相同情况下，固体采用纱布封口得到的洛伐他汀含量较其他2种方式均高，在固体培养基封口方式相同情况下，种子液培养基采用试管膜封口得到的洛伐他汀含量较其他2种方式均低，这与不同的封口方式、透气性不同有关系，透气性差不利于红曲霉的次级代谢，这与文献报道的增加发酵瓶中的透气量对高产MonacolinK有利是一致的[10]。

综合分析洛伐他汀合成量，低温前10d，洛伐他汀增长迅速，之后洛伐他汀增长趋势放缓，这与研究报道相吻合[9，11]。当固体培养基采用纱布封口，同时种子液培养基采用纱布或棉塞封口时，红曲中洛伐他汀的长速较快，洛伐他汀的产量最高。

4 讨论

传统红曲发酵工艺由于不能有效控制通风、温度、湿度等重要发酵条件，所得红曲的活性成分较低，且桔青霉素污染严重。红曲发酵产洛伐他汀不仅受培养基组成的影响，培养条件对代谢产物洛伐他汀的产生也有显著的影响，特别是通气性，其在红曲发酵过程中占据重要的作用[15-17]。因此，控制适当的通气量对红曲发酵非常关键。影响固态发酵过程中通气性的因素包括发酵装置、装样、初始含水量、翻曲频率等均有所报道，本试验则吸取前人的优秀成果结合企业目前的生产工艺，从固体与种子液培养基的封口方式研究通气条件对红曲产洛伐他汀的影响。试管膜使用方便，但在长期的生产中，笔者发现该封口方式洛伐他汀的产量一直很难有所提高，本次研究有效证明了由于试管膜的通气性较差影响了最终的洛伐他汀含量；棉塞是传统的封口方式，但由于存在易污染、难清洗等问题，在生产中已逐渐不再采用；纱布封口不仅通气量是3种方式中最适宜的，而且易清洗，可重复利用，也比较符合工业化生产的成本控制原则，为进一步优化工业化生产的发酵条件、改善红曲发酵工艺提供了新思路。◇

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