羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液的生物相容性研究

韩颖 徐玉茵 周静 田林奇 柳小军 张娇娇 河南省医疗器械检验检测工程研究中心 （河南 郑州 450000）

手术性粘连现象普遍存在于外科手术后，不仅给患者带来了一定的躯体痛苦而且加重了患者的经济负担[1]。研究表明，壳聚糖作为一种生物材料，具有止血、抗炎、抑制成纤维细胞生长等作用，是预防伤口粘连的理想材质[2]。羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液属于壳聚糖类衍生物，为无色透明或微黄色澄清液体，常用于术后伤口冲洗，具有防止创面粘连，促进伤口愈合的作用[3]。为了保障其临床应用的安全性，本研究按照GB/T 16886《医疗器械生物学评价标准》的要求，对羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液进行生物学安全性评价。

1.资料与方法

1.1 一般资料

实验材料：小鼠成纤维细胞L-929（ATCC），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），MTT（Sigma），MEM（Gibco），完全弗氏佐剂（Sigma），成年新西兰兔（华兰生物疫苗有限公司，合格证号：41001700005019），质量2.2～2.7kg，健康初成年白化豚鼠（华兰生物疫苗有限公司，合格证号：41001700005096），质量300～500g。

1.2 方法

1.2.1 体外细胞毒性试验[4]

无菌条件下取样品，按照0.1g/mL的浸提比例制备样品浸提液。将处于对数生长期的L-929细胞用胰酶消化后，加入细胞培养液，调整细胞浓度为1×104个/mL。将配置好的细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μL。置5%CO2培养箱37˚C，培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜MEM细胞培养液，供试品组加入样品浸提液，阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液，阳性对照组加入含5%二甲基亚砜的培养液，每孔100μL，置CO2培养箱继续培养72h。更换培养液72h后，将上述各组置于显微镜下观察细胞形态，并在每孔加入5g/L的MTT溶液20μL。继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μL的DMSO，振荡10min后，在570nm和630nm波长下用酶标仪测定吸光度，并计算相对增值率（试验组吸光值/空白对照组吸光值×100%）。按表1进行分级标准判定。

表1.细胞毒性反应分级(%)

表2.试验样品的细胞相对增值率

1.2.2 皮内反应试验[5]

取新西兰兔3只，于试验前12h，剃除家兔背部脊柱两侧被毛。在每只兔脊柱一侧的5个点皮内注射0.2mL生理盐水制备的样品浸提液，脊柱同一侧后5个点注射生理盐水对照液。在每只兔的脊柱另一侧注射植物油制备的样品浸提液和植物油对照液，操作步骤同上。注射后即刻并在24h、48h、72h观察记录各注射部位状况，按标准给出的记分系统对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分，并记录试验结果。在72h评分后，分别将每一试验样品和溶剂对照的全部红斑与水肿记分相加，再除以18 [3（动物数）×3（观察期）×2（记分类型）]，计算出每一试验样品和每一对应溶剂对照的综合平均记分。

1.2.3 迟发型超敏反应试验[5]

取豚鼠15只，分为试验组10只，对照组5只，分别剃除动物肩胛骨后侧被毛。试验组在去毛区域的上、中、下部位分别注射A液（弗氏完全佐剂与生理盐水1:1混合乳化剂）、样品浸提液、样品浸提液与A液（1:1）的混合液，左右对称各2点。阴性对照组使用同批号生理盐水，操作同试验组。皮内诱导7d后，用用浸透样品浸提液和阴性对照液的滤纸片覆盖诱导注射点。用封闭式绷带固定滤纸片，并于48h后去除包扎。局部诱导后14d后，剃除豚鼠上腹部被毛，将浸透样品浸提液和阴性对照液的滤纸片敷贴于去毛部位，封闭固定24h。解除包扎后24h和48h观察两组动物激发部位的皮肤反应情况。按标准中的分级对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。

2.结果

2.1 细胞毒性试验

倒置显微镜下观察可见，阳性组细胞数量少，形态呈球形。空白对照组和阴性对照组的细胞生长状态良好，细胞呈梭形。试验样品组可见少量圆形细胞，MTT检测结果为细胞的相对增值率为80%。说明羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液为极轻的细胞毒性。详细结果见表2。

2.2 皮内反应试验

试验结果表明，样品的两组浸提液与其相应溶剂对照液的平均记分之差均为0，所以在本试验条件下，试验样品无皮内刺激反应。

2.3 迟发型超敏反应试验

试验结果表明，试验组和对照组动物的皮肤均未出现红斑和水肿现象。因而，试验样品等级评分为0，即在本试验条件下，样品无致敏反应。

3.讨论

在外科手术后发生组织粘连是临床上一种常见的现象，特别是在腹部手术后的粘连常带来严重的并发症，如肠梗阻、盆腔炎等，这种现象给患者的身心带来极大伤害，使患者的生活质量下降，因此降低术后粘连的发生率显得至关重要。理想的防粘连材料应具有良好的生物相容性、自动黏附性、促进伤口愈合并将纤维组织增生降至最低程度等特性。

本研究按照GB/T 16886《医疗器械生物学评价标准》的要求，采用细胞毒性、皮内反应、迟发型超敏反应对羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液进行生物学安全性评价。结果表明羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液具有良好的生物相容性。

[1]Moris D, Chakedis J, Rahnemai-Azar AA, et al.Postoperative Abdominal Adhesions: Clinical Significance and Advances in Prevention and Management[J].J Gastrointest Surg.2017,21(10):1713-1722.

[2]Zhu L, Peng L, Zhang YQ.The processing of chitosan and its derivatives and their application for postoperative anti-adhesion[J].Mini Rev Med Chem,2015,15(4):330-337.

[3]苏朝晖,谭洁银.羧氨基葡聚多糖钠生物胶体液在妇产科腹盆腔手术后的应用效果[J].北方药学,2016,13(4):10-11.

[4]国家药品监督管理局.GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》[S].北京:中国标准出版社,2003.

[5]国家药品监督管理局.GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验》[S].北京:中国标准出版社,2005.