屠体羊卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

郎洪彦，刘晓辉，张鹏举，王伟霞，刘海燕，谭成成，李信涛

（吉林省农业科学院畜牧科学分院，公主岭 136100）

随着牛、羊体外受精和胚胎移植技术在生产应用中的快速发展，以及体细胞核移植和转基因等胚胎工程技术的深入开展，如何稳定获得高质量的成熟卵母细胞已经成为该领域中的一个极其重要的问题。卵母细胞虽然可以通过超数排卵、活体采卵等方式获得，但其成本高昂，无法广泛开展。因此，目前广泛被采用的方法主要是通过收集屠宰场废弃的卵巢来获得体外成熟的卵母细胞［1］。在某些特定的条件下，卵巢的收集和运输往往需要较长的时间，同时屠宰时间大多数都在夜间进行，给后续的工作带来许多不便。如果能够建立良好的卵巢保存体系，使其在一定时间内的储存不对卵母细胞的体外成熟和成熟后的发育能力造成不利影响，就会为相应的研究工作和生产应用带来极大的便利。

目前，屠体卵巢都是保存在含少量抗生素的生理盐水中，但保存温度、保存时间尚不统一，保存温度从20～39℃都有报道［2-4］。有研究表明，牛卵巢在 37～39℃和 4℃保存5～8 h，卵母细胞的成熟及发育能力就会降低，而将卵巢在20～25℃保存8 h，并没有影响卵母细胞的成熟及发育能力。本试验探讨了在相同保存温度（15～20℃）下，延长屠体羊卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响，为体外受精等胚胎工程技术奠定基础。

1 材料与方法

本试验TCM-199购自Gibco公司，FSH、LH购自宁波激素制品厂；其他试剂若无特殊说明，均购自Sigma公司。

1.1 羊屠体卵巢的采集

羊卵巢从当地屠宰场采集，保存在含青、链霉素的生理盐水中，2～3 h内送至实验室，用含青、链霉素的生理盐水冲洗卵巢3～5次，保存在15～20℃的生理盐水中，保存时间从运至实验室放入生理盐水中开始计时。

1.2 卵母细胞的采集

用连有12G针头的10 mL注射器抽取卵巢表面上直径2～5 mm卵泡中的卵母细胞，吸卵前在注射器中预先抽入1 mL吸卵液，置于50 mL离心管中，37℃水浴静止10 min，待卵母细胞沉降后，弃上清，用PVA-TLHEPES溶液清洗3次，体视显微镜下挑选胞质均匀、颗粒细胞2层以上的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），计数后用于体外成熟培养（IVM）。

1.3 卵母细胞的体外成熟（IVM）

将COCs用体外成熟培养液（IVM液）洗3～5次，然后将15～20枚COCs移入50 μL成熟培养滴中，成熟培养24～27 h，用于体外受精（IVF），成熟液滴使用前需在CO2培养箱中平衡2 h以上。培养条件为5%CO2、95%空气、38.5℃、饱和湿度。

IVM 液：TCM199-HCO3+10%FBS+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL estradiol+100 IU/mL Antibiotic。

1.4 体外受精（IVF）

将成熟的卵母细胞（COCs）置于0.05%透明质酸酶液中反复吹打冲洗，除去部分卵丘细胞，保留2～3层卵丘细胞，用受精液（IVF液）清洗3次，将15～20枚成熟卵母细胞放入预先平衡好的50 μL受精滴中。将液氮中保存的羊细管冻精于39℃水温迅速解冻，缓缓注入含1 mL受精液的离心管底部，斜45°放置于38.5℃培养箱中孵育30 min，吸取上部精液移入1.5 mL离心管中，1 350 r/min离心4 min，弃上清，调整精子密度为2×106个/mL用于体外受精（IVF）。

IVF液：SOF+20%（或2%）FBS+5 IU Heparin。

1.5 胚胎体外培养（IVC）

精卵共孵育24 h，去除颗粒细胞和附着的精子，受精卵用胚胎培养液清洗3次，mSOF培养体系［5］。将受精卵移入500 μL培养液的四孔板中，每48 h换1/3培养液，培养条件为 5%CO2、5%O2、90%N2、38.5℃、饱和湿度。48 h统计卵裂率，6～8 d统计囊胚率。

1.6 数据分析

每组试验重复3次，试验数据采用student t检验进行分析处理。

2 结果与分析

由表1可见，在相同保存温度15～20℃下，延长卵巢保存时间至6 h和12 h，卵母细胞的成熟率、卵裂率及囊胚率没有受到影响，保存18 h卵母细胞的成熟率、卵裂率及囊胚率虽有所降低，但差异不显著（P＞0.05），仍可继续发育。由此得知，过夜保存6～18 h的羊屠体卵巢其卵母细胞的成熟率、体外受精后卵裂率及囊胚率与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。

表1 卵巢保存时间对卵母细胞发育能力的影响

3 讨论

理论上，屠宰场收集的卵巢应立即采集并回收卵母细胞效果最佳。实际上，由于屠宰场规模参差不齐并与实验室均有一定的距离，所以对卵巢运输过程中的保存、温度及时间就有一定的要求。其中，生理盐水的温度是相对可以控制的因素，但保存的温度及时间还存在很大差异。Gordon［6］认为，动物屠宰后，卵巢应置于 30～37℃无菌生理盐水中尽快送至实验室即可。Moor等［7］也认为，温度低于30℃，卵母细胞发育就会降低。而王建辰等［8］认为，温度过高会使卵母细胞成熟加快，产生大量无法排出的有害物质，影响卵母细胞的成熟及进一步发育。李青春等［9］也研究发现，卵巢温度升高会导致卵母细胞新陈代谢加快。Lee等［10］认为，低温保存会导致卵母细胞内部微结构的轻度损伤，但可以明显降低卵母细胞的代谢反应，适当地降低温度可以减少有害物质代谢，防止发育基因和蛋白质降解。Yang等［11］对牛卵巢保存温度、时间对卵母细胞及体外受精效果的影响进行了研究，结果表明，卵巢在37℃和4℃保存4 h后，卵母细胞卵裂率和囊胚率均显著降低（P＜0.05），而在20～25℃保存8～11 h，则不会影响卵母细胞的成熟率、受精后卵裂率及囊胚率。谭世俭［12］的研究也表明，牛卵巢保存温度≥27℃或≤14℃，也会导致卵母细胞成熟率及卵裂率降低，在适当的温度保存14 h后，则不会影响其发育能力。

本试验研究了在相同保存温度（15～20℃）下，延长屠体羊卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟及体外受精的影响。结果表明，在15～20℃下，延长卵巢保存时间，不影响羊卵母细胞继续发育。

［1］Galli C，Duchi R，Crotti G，et al.Bovine embryo technologies［J］.Theriogenology，2003，59（2）：599-616.

［2］Ferreira M A，Brasil A F，Silva J R，et al.Effect of storage time and temperature on atresia of goat ovarian preantral follicle held in M199 with or without indole-3-acetic acid supplementation［J］.Theriogenology，2001，55：1607-1617.

［3］Ravindranatha B M，Nandi S，Raghu H M，et al.In vitro maturation and fertilization of buffalo oocytes：effects of storage of ovaries，IVM temperature，storage of processed sperm and fertilization media［J］.Reproduction in Domestic Animals，2003，38（1）：21-26.

［4］刘晓辉，曹阳，郎洪彦，等.培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响［J］. 安徽农业科学，2011，39（20）：12229-12230.

［5］Holm P，Booth P J，Schmidt MH，et al.High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins［J］.Theriogenology,1999，52(4)：683-700.

［6］Gordon I.In vitro maturation（IVM）and fertilization（IVF）of cattle ova［J］.Embryo Transfer Newsletter，1990，8：6-11.

［7］Moor R M，Crosby I M.Temperature-induced abnormalities in sheep oocytes during maturation［J］.Reproduction，1985,75：467-473.

［8］王建辰，张孝荣.动物生殖调控［M］.合肥：安徽科学技术出版社，1998：220-230.

［9］李青春，李武峰，岳文斌，等.不同卵巢运输温度和培养方法对卵母细胞体外成熟的影响［J］.畜牧兽杂志，2008，27（4）：16-17.

［10］Lee H S，Yin X J，Kong I K.Sensitivity of canine oocytes to low temperature［J］.Theriogenology，2006，66(6)：1468-1470.

［11］Yang N S,Lu K H，Gordon I.In vitro fertilization（IVF）and culture（IVC） of bovine oocytes from stored ovaries［J］.Theriogenology,1990，33（1）：352.

［12］谭世俭.利用体外受精技术产业化生产奶牛胚胎——长距离运送卵巢的保存温度的影响［J］.中国兽医学报，2004，24（4）：398-401.