N-乙酰半胱氨酸对氧化应激所致胰岛素原成熟障碍的改善作用

李一卉，孙璐，戴程婷，袁庆新(南京医科大学第一附属医院，南京210029)

糖尿病是一类由遗传、环境、免疫功能紊乱等因素诱发的严重危害健康的慢性疾病，其病因和发病机制尚未完全明确[1]。研究发现，氧化应激(OS)在糖尿病发病机制中发挥了重要作用[2]。内质网是所有分泌型蛋白和膜蛋白折叠、成熟、储存和转运的场所。近年研究发现，内质网应激(ERS)与糖尿病胰岛β细胞功能减退和胰岛素抵抗密切相关，OS与ERS的相互作用将会加重胰岛β细胞的损伤[3～5]。胰岛素原是胰岛素的前体物质，可裂解为一分子胰岛素和一分子C肽[6]。胰岛素原能否在内质网中正确折叠、进而成熟为构象未成熟胰岛素原复合物(CIPC)，对于胰岛素的合成及释放起重要作用。2016年2月～2017年2月，我们观察了抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对OS所致胰岛素原成熟及胰岛β细胞分泌胰岛素功能的影响，探讨减轻OS对改善胰岛β细胞功能的作用及机制，为预防糖尿病的发生和发展提供新方向。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 小鼠胰岛细胞系MIN6细胞来源于南京医科大学生物化学系德伟教授实验室。高糖DMEM完全培养基(含有15 %胎牛血清、50 μmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)、胎牛血清、双抗(Gibco公司，美国)；β-巯基乙醇、台盼蓝、过氧化氢(H2O2，Sigma公司，美国)；2′7′-二氯荧光素-乙酰乙酸酯(H2DCFDA，Invitrogen公司，美国)；胰岛素原单克隆抗体、胰岛素多克隆抗体、管蛋白(Tubulin)多克隆抗体(Abcam公司，英国)；胰岛素放免试剂盒(北京北方生物科技研究所，中国)。

1.2 细胞培养 MIN6细胞在高糖DMEM完全培养基中培养，细胞贴壁生长，放入37 ℃、5% CO2培养箱中，每天换液。待细胞密度达75%以上时，按1∶2传代。

1.3 H2O2最佳干预剂量的确定 培养MIN6细胞，生长到对数生长期时，胰酶消化，PBS清洗；终止消化后，加培养基吹匀，然后取等量细胞液种植在6孔板中；待细胞密度达75%左右时，选取不同浓度(0、11 nmol/L、22 nmol/L、44 nmol/L、88 nmol/L及10 μmol/L)H2O2加入培养基，测定不同H2O2浓度时细胞死亡率及蛋白中CIPC含量；发现当H2O2浓度为10 μmol/L时，CIPC含量明显增加，且细胞保持较低的死亡率，从而确定10 μmol/L H2O2作为OS干预的最佳剂量。

1.4 细胞分组及干预方法 分为对照组、H2O2处理组、H2O2+NAC处理组。对照组在培养基中不加入H2O2及NAC处理；H2O2处理组在培养基中加入10 μmol/L H2O2处理；H2O2+NAC处理组培养基中加入10 μmol/L H2O2刺激4 h后，再加入250 μmol/L NAC处理。各组细胞再次放入37 ℃、5 % CO2培养箱中，培养24 h。

1.5 细胞死亡率检测 采用台盼蓝染色法。各组细胞放入37 ℃、5% CO2培养箱中，培养24 h。向各组培养皿中加入台盼蓝试剂，于显微镜下观察细胞生存状态、形态；并对死亡及生存细胞进行手动计数，计算细胞死亡率。

1.6 细胞中活性氧簇(ROS)表达水平检测 采用H2DCFDA荧光探针法。取各组细胞，胰蛋白酶消化，收集细胞；用PBS洗涤后，加入H2DCFDA，放在37 ℃孵育30 min。PBS洗涤3次，荧光酶标仪检测荧光强度，荧光强度越强代表ROS表达水平越高。

1.7 MIN6细胞胰岛素原、CIPC蛋白表达检测 采用Western blotting法。取各组细胞，提取细胞总蛋白；运用非还原Tris-tricine-urea-SDS-PAGE胶进行电泳[7]，采用Western blotting法检测细胞中胰岛素原、CIPC蛋白表达。以Tubulin作为内参。计算胰岛素原/CIPC比例。

1.8 细胞上清胰岛素相对含量检测 采用放免法(RIA)。取各组细胞上清，4 ℃ 700 r/min离心10 min，取离心后上清150 μL。采用RIA法检测胰岛素，所用仪器型号为DFM-96型16管手动放射免疫γ计数器，计算各组细胞上清胰岛素相对含量。

2 结果

2.1 各组细胞死亡率比较 H2O2处理组细胞死亡率高于对照组，H2O2+NAC处理组细胞死亡率低于H2O2处理组(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组细胞ROS表达水平比较 H2O2处理组细胞ROS表达水平高于对照组，H2O2+NAC处理组细胞ROS表达水平低于H2O2处理组(P均<0.05)。见表1。

2.3 各组细胞胰岛素原/CIPC比较 H2O2处理组细胞胰岛素原/CIPC低于对照组，H2O2+NAC处理组细胞胰岛素原/CIPC高于H2O2处理组(P均<0.05)。见表1、图1。

图1 各组细胞胰岛素原、CIPC表达情况(Western blotting法)

2.4 各组细胞上清胰岛素相对含量比较 H2O2处理组细胞上清胰岛素相对含量低于对照组，H2O2+NAC处理组细胞上清胰岛素相对含量高于H2O2处理组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞检测指标比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与H2O2处理组比较，△P<0.05。

3 讨论

糖尿病临床诊断明确时，胰岛β细胞的功能已经损伤明显。如何在糖尿病早期进行有效的干预，是保护胰岛β细胞功能、延缓和预防胰岛β细胞凋亡的重要方法。胰岛素的正确合成是维持血胰岛素水平的基础，首先是编码胰岛素的基因经过转录、翻译，形成前胰岛素原；然后前胰岛素原在内质网剪切信号肽，形成胰岛素原；胰岛素原再移位到高尔基体，剪切成胰岛素和C肽储存在细胞质的囊泡中，最后释放入血[8,9]。近来有学者认为，胰岛素原向胰岛素的转换异常，即正确折叠的胰岛素原减少、CIPC大量堆积，是糖尿病发生的重要原因[10]。

胰岛β细胞具有高度发达的内质网，这与其需要合成和分泌大量的胰岛素及多种糖蛋白相适应，也容易受到各种应激的损伤。其中，OS作为糖尿病发生、发展的重要原因，已被广大学者认可[2]。由于体内氧化与抗氧化作用失衡，从而导致中性粒细胞炎性浸润、蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，这是ROS在体内产生的一种负面作用[11]。内质网的氧化环境对于蛋白质的合成及分泌亦至关重要[12]，它参与二硫键的形成、蛋白质的折叠和装配、糖基化、聚糖作用，还是Ca2+贮存的重要场所[6]，分泌蛋白的正确折叠对是维持其功能正常的首要条件。未折叠或错误折叠的蛋白不能正常分泌，在细胞堆积时，即通过泛素/蛋白酶体系统、溶酶体系统或通过自噬的方式被降解、清除。胰岛素原在内质网进行合成的过程中，若发生错误折叠，可导致CIPC的产生。一方面，CIPC不能进行下一步剪切，从而使胰岛素合成减少，引起血糖升高。另一方面，胰岛素原因转换为CIPC无法输出而堆积，不仅会引起ERS，还可能使内质网腔的Ca2+渗出；细胞质Ca2+浓度的升高刺激线粒体产生更多的活性ROS，诱发或加重OS[6]，OS与ERS的相互作用、恶性循环可能加重β细胞的损伤[5]。所以，蛋白质错误折叠和ROS的产生是紧密相关的事件，但联系二者的机制尚不明确。胰岛素原错误折叠及成熟障碍很可能是OS及ERS引起糖尿病发生、发展的重要原因[13,14]。本研究发现，H2O2处理组与对照组相比，细胞死亡率升高、ROS表达水平升高、胰岛素原/CIPC降低、上清胰岛素含量相对减少。这表明OS加重了胰岛素原的错误折叠并堆积，并可导致胰岛β细胞出现OS损伤、死亡及胰岛素分泌功能障碍。因此，如何减轻OS损伤，从而减少胰岛素原的错误折叠、促进胰岛素原的成熟，可能是保护胰岛β细胞功能、预防糖尿病进展的有效方法。

研究发现，抗氧化剂可以减轻糖尿病症状及血糖水平[15,16]。NAC是含巯基的抗氧化剂，是体内合成谷胱甘肽的原料，能清除体内的ROS，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被氧化，但其降糖机制尚不明确。本研究显示，H2O2+NAC处理组较H2O2处理组细胞死亡率降低、ROS表达水平降低、胰岛素原/CIPC升高、上清胰岛素相对含量增加。这提示NAC可以改善H2O2导致的胰岛β细胞损伤，还可以改善OS引起的胰岛素原成熟障碍及胰岛素的释放异常，有效地保护胰岛β细胞功能。

综上所述，NAC可以改善H2O2导致的胰岛β细胞损伤，改善OS引起的胰岛素原成熟障碍及胰岛素的释放异常，有效保护胰岛β细胞功能。因此，胰岛素原成熟障碍、降解增多及相关的ERS和OS可能是糖尿病早期干预的重要靶点。但是，ERS是泛在的保护机制，ERS和OS关系究竟如何，以及抗氧化剂改变OS的具体机制尚待深入研究。

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