胰高血糖素对不同葡萄糖培养条件下胰岛β细胞分泌胰岛素的影响及机制

丁艳洁，李思源，李军，常子涛，张震，吴媛媛(石河子大学医学院，新疆石河子8300；石河子大学医学院第一附属医院)

糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病。研究表明，无论1型还是2型糖尿病的发病都与胰岛素(INS)分泌异常有关[1,2]。因此，关于INS分泌的作用机制及其影响因素已成为近年来国内外研究的热门方向。胰高血糖素(Gn)和INS之间存在着拮抗作用：当血糖浓度过低时，Gn分泌增多，使血糖含量升高；当血糖浓度过高时，INS分泌增多，使血糖含量降低。本课题组前期研究表明，Gn在不同浓度葡萄糖环境下，均可促进胰岛β细胞分泌INS[3～5]，但其具体机制尚不明确。环磷酸腺苷(cAMP)是一种由三磷酸腺苷(ATP)脱掉两个磷酸羧合而成的环状核苷酸，当血糖升高时，Gn可以刺激ATP环化为cAMP，从而增加其浓度。2016年10月～2017年1月，我们对胰岛β细胞系MIN6细胞在不同浓度葡萄糖环境下进行Gn干预，观察对INS及cAMP含量的影响，探讨Gn影响INS分泌的机制，为糖尿病治疗药物的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 胰岛β细胞系MIN6细胞。主要试剂有cAMP信号通路刺激剂盐酸异丙肾上腺素(ISO)、0.25%含EDTA-胰蛋白酶液、小鼠INS-ELISA试剂盒、cAMP-ELISA试剂盒等。

1.2 细胞培养 用含15%胎牛血清(FBS)、4.5 g/L葡萄糖、2%青链霉素、1%L-谷氨酰胺及1%β-巯基乙醇的DMEM培养基，在37 ℃含5%CO2的培养箱中培养，传代至4～15代用于实验。

1.3 不同浓度Gn对MIN6细胞分泌INS及cAMP影响的观察

1.3.1 分组及干预方法 取对数生长期的MIN6细胞，以4×105/孔的密度接种于6孔板中，分为正常对照1组、低糖1组、高糖1组，分别在葡萄糖终浓度为0、2.8、16.7 mmol/L培养基中培养，每组均给予0、500、1 000 ng/L的Gn干预1 h。

1.3.2 细胞上清液INS含量检测 采用ELISA法。各组细胞接种于6孔培养板，换2%FBS的培养基37 ℃培养12 h后，Krebs液冲洗3遍，之后每孔分别加不同刺激的处理液，正常对照组的0 ng/L水平加入Kerbs液，37 ℃孵育1 h；吸取每孔上清液分装，用INS-ELISA试剂盒检测INS含量。

1.3.3 细胞上清液cAMP含量检测 采用ELISA法。各组细胞接种于6孔培养板，用不含FBS的培养基饥饿处理12 h，之后每孔分别加入不同刺激液1 mL处理，正常对照组的0 ng/L水平加入同体积Kerbs液，37 ℃培养箱孵育7 min。吸除刺激液，每孔加0.1 mmol/L的HCl 1 mL，室温孵育20 min；收集上清液，用cAMP-ELISA试剂盒检测cAMP含量。

1.4 加入ISO后不同浓度Gn对MIN6细胞分泌INS及cAMP影响的观察

1.4.1 分组及干预方法 取对数生长期的MIN6细胞，以4×105/孔的密度传代于6孔板中，分为正常对照2组、低糖2组、高糖2组，分别在葡萄糖终浓度为0、2.8、16.7 mmol/L培养基中培养，并均加入500 μL ISO，37 ℃孵育10 min，然后每组均给予0、500、1 000 ng/L的Gn干预1 h。

1.4.2 细胞上清液INS及cAMP含量检测 同1.3.2、1.3.3。

2 结果

2.1 不同浓度Gn对MIN6细胞分泌INS及cAMP的影响

2.1.1 细胞上清液INS含量比较 正常对照1组、低糖1组、高糖1组中，1 000 ng/L Gn干预后INS含量高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后INS含量均高于0 ng/L时(P均<0.05)。见表1。

2.1.2 各组细胞上清液cAMP含量比较 正常对照1组中，1 000 ng/L Gn干预后cAMP含量高于0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后cAMP含量高于0 ng/L时(P均<0.05)。低糖1组、高糖1组中，1 000 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于0 ng/L时(P均<0.05)。见表2。

2.2 加入ISO后不同浓度Gn对MIN6细胞分泌INS的影响

2.2.1 细胞上清液INS含量比较 正常对照2组、低糖2组、高糖2组中，1 000 ng/L Gn干预后INS含量均高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后INS含量均高于0 ng/L时(P均<0.05)。见表1。

表1 不同浓度Gn条件下各组细胞上清液INS分泌量比较

注：与同组0 ng/L比较，*P<0.05；与同组500 ng/L比较，﹟P<0.05。

2.2.2 各组细胞上清液cAMP含量比较 正常对照2组、低糖2组、高糖2组中，1 000 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于0 ng/L时(P均<0.05)。见表2。

表2 不同浓度Gn条件下各组细胞上清液cAMP含量比较

注：与同组0 ng/L比较，*P<0.05；与同组500 ng/L比较，﹟P<0.05。

2.3 细胞上清液cAMP与INS含量的相关性 在未添加ISO时，细胞上清液cAMP与INS含量呈正相关(r=0.897 2，r2=0.804 9，P<0.05)；在添加ISO后，细胞上清液cAMP与INS含量也呈正相关(r=0.894 7，r2=0.800 5，P<0.05)。见图1、2。

3 讨论

糖尿病是一种由于INS分泌不足和(或)INS抵抗而引起的代谢性疾病，除INS分泌绝对不足的1型糖尿病外，2型糖尿病患者亦表现为胰岛β细胞INS分泌功能的缺陷。β细胞的INS分泌过程受到各种供能物质及激素、多肽和神经递质类等多种因素的调控[6]，其中如Gn、Gn样肽等激素，不直接引起INS分泌，但可通过作用于胰岛β细胞，增加或减少细胞内第二信使信号系统的某些第二信使的浓度，发挥调节INS分泌的作用[7]。以往的研究大都针对如何减少Gn，而Gn对胰岛β细胞INS分泌功能的影响则研究较少。

图1 未添加ISO时细胞上清液中cAMP与INS含量相关性散点图

图2 添加ISO后细胞上清液中cAMP与INS含量相关性散点图

本课题组前期研究发现，Gn对INS分泌有促进作用[8]。Gn可能通过旁分泌作用直接到达临近的β细胞，对INS分泌产生调节作用；也可能通过先与细胞膜上的Gn受体结合，引起腺苷酸环化酶活化，从而使ATP环化为cAMP，再通过cAMP-PKA第二信使信号途径实现[9,10]。因此，第二信使信号分子cAMP可能是Gn参与调控INS分泌的桥梁[11,12]，但其影响作用的机制和具体环节尚不十分清楚。本研究发现，正常对照1组、低糖1组、高糖1组中，1 000 ng/L Gn干预后INS的分泌量高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后INS的分泌量均高于0 ng/L时；提示Gn干预可促进不同葡萄糖水平的细胞上清液INS含量升高[13]，且Gn浓度较高时对INS含量的促进作用更明显；正常对照1组、低糖1组、高糖1组中，1 000 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于0 ng/L时，提示Gn干预可使不同葡萄糖水平的细胞上清液cAMP含量升高，且Gn浓度较高时对cAMP含量的促进作用更明显。cAMP含量与INS分泌量呈正相关关系，提示Gn干预可使不同葡萄糖水平的细胞上清液INS含量升高的机制可能与cAMP有关。

本研究进一步通过添加cAMP刺激剂ISO，测定Gn对第二信使信号通路cAMP产生的影响以及对INS分泌的影响。本研究发现，正常对照2组、低糖2组、高糖2组中，1 000 ng/L Gn干预后INS含量均高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后INS含量均高于0 ng/L时；提示加入ISO后，Gn干预可使不同葡萄糖水平的细胞上清液INS含量升高，且Gn浓度较高时对INS含量的促进作用更明显。正常对照2组、低糖2组、高糖2组中，1 000 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于500、0 ng/L时，500 ng/L Gn干预后cAMP含量均高于0 ng/L时；提示加入ISO后，Gn干预可使不同葡萄糖水平的细胞上清液cAMP含量升高，且Gn浓度较高时对cAMP含量的促进作用更明显。cAMP含量与INS分泌量呈正相关关系，提示Gn干预可使不同葡萄糖水平的细胞上清液INS含量升高的机制可能与cAMP有关。

综上所述，Gn可促进不同葡萄糖水平下胰岛β细胞INS的分泌，其浓度较高时对INS促进作用更明显；其机制可能为Gn通过cAMP信号通路促进INS分泌。本研究结果为研究促进INS分泌类的糖尿病治疗药物开发提供了实验室依据，对糖尿病病程的进展与治疗预后等具有重要意义。

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