早卵泡期超长方案鲜胚移植策略及临床妊娠结局分析

田莉峰，吴兴武，苏琼，李游，许定飞，伍琼芳

(江西省妇幼保健院辅助生殖中心，南昌 330006)

辅助生殖技术的终极目标是让每一对不孕不育夫妇获得一个健康的孩子。如何在不降低妊娠率的情况下有效避免多胎妊娠，降低孕期母婴并发症，一直是辅助生殖领域近年来研究的一个热点问题。大量研究发现囊胚期胚胎具有更好的发育潜能，移植囊胚期胚胎可以提高胚胎种植率。随着实验室设备及技术的提高和培养条件的完善，囊胚形成率越来越高。单囊胚移植将成为生殖专家和不孕患者的最佳选择。但目前较多研究集中在单囊胚移植和卵裂期胚胎移植的临床妊娠结局，对进一步的母婴安全性及产科结局研究较少。本研究通过比较单卵裂期胚胎移植、单囊胚移植及双卵裂期胚胎移植组间实验室、临床妊娠结局及产科安全性，探讨选择性单囊胚移植的应用前景。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择本中心2015年1月-2016年6月行体外受精/卵细胞内单精子显微注射-胚胎移植 （IVF/ICSI-ET）治疗的早卵泡期超长方案患者。行单卵裂期胚胎移植患者为SET组，单囊胚移植患者为SBT组，行双卵裂期胚胎移植患者为DET组。纳入标准：不孕年限≥1年；第一次行IVF/ICSI-ET助孕治疗；至少具备以下一种IVF/ICSIET助孕指征，即输卵管因素、男方因素、排卵障碍、子宫内膜异位症。排除标准：具有以下子宫异常的患者，即子宫畸形（单角子宫、双角子宫、双子宫、纵膈子宫）、黏膜下子宫肌瘤及宫腔粘连；输卵管积水；患者或者其丈夫染色体核型异常者；有ART禁忌症或妊娠禁忌症的患者，如未控制的糖尿病、未明确诊断的肝肾功能异常、深静脉血栓史、肺栓塞史、脑血管意外史、未控制的高血压、心脏病、可疑宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌或既往病史以及未明确诊断的阴道流血。患者夫妻双方均理解并签署知情同意书。

1.2 方法 早卵泡期超长方案：在患者月经来潮第2-3d肌肉注射促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)（注射用醋酸亮丙瑞林微球3.75mg/支，上海丽珠制药有限公司）3.75mg 1支，28-30d后行B超及内分泌检查，若垂体完全降调节（子宫内膜厚度≤5mm，血清 FSH＜5mIU/ml，黄体生成素 LH＜5mIU/ml，E2＜50pg/ml），开始给予Gn 75-300IU/d启动超排卵周期，5d后B超监测卵泡生长大小，并监测血清激素水平，根据卵泡生长发育速度调整Gn用量，直至HCG注射日止。当至少有1个卵泡直径≥19mm或2个卵泡直径≥18mm时于当晚给予HCG（艾泽250μg/支，默克雪兰诺公司，德国）250μg皮下注射，36h后在阴道B超引导下取卵，卵母细胞在体外培养3-6h后进行常规体外受精或单精子胞浆内注射，精液处理及受精采用我中心常规方案。取卵当日给予黄体酮针剂60mg/d进行黄体支持。单、双卵裂期胚胎移植组于受精后第3d分别选择最优质的1、2枚胚胎在腹部B超引导下进行移植，根据卵裂球大小、均匀与否及无核碎片量的多少进行胚胎质量评级，将胚胎分为4级。将D3为7-9细胞数的Ⅰ、Ⅱ级胚胎评为优质胚胎。选择性单囊胚移植组患者在受精后第5d选择3期以上囊胚1枚进行移植，如无3期以上囊胚，培养至第6d，如无4期以上囊胚，放弃移植。根据Gardner囊胚分级法对形成的囊胚进行分级。将D5-6囊胚分级≥3级，且其内细胞团（inner cell mass，ICM）为 A或 B级定为优质囊胚。若获卵超过15枚患者需在移植当日行阴道超声检查，若卵巢直径≥7cm或自觉腹胀、胃胀者考虑移植后有中-重度OHSS发生可能行全胚冷冻，脱落出组。移植后改用黄体酮阴道缓释凝胶8%（雪诺酮90mg/支，默克雪兰诺公司，德国）每天1支及地屈孕酮片（达芙通10mg/片，荷兰苏威制药公司）早晚各1片，囊胚移植后10d或卵裂期胚胎移植后12d查血HCG确定是否生化妊娠，移植后1个月行B超检查，见胚芽及心搏诊断为临床妊娠，并同时确定孕囊数，黄体支持从取卵日开始维持至孕10周。随访分娩时产妇孕周、新生儿出生体重、孕期并发症及新生儿合并症等。

1.3 观察指标 观察各组患者的一般临床情况及各项对比指标，包括年龄，不孕年限，月经周期第2-5d基础激素水平，HCG日血清E2、P水平及内膜厚度，Gn天数，Gn总量，获卵数，临床妊娠率，早期流产率，晚期流产率、多胎妊娠率，宫外孕率，剖宫产率，早产率，中重度OHSS发生率，抱婴率，母亲分娩孕周，新生儿出生体重，孕期母亲并发症发生率等。

1.4 统计学处理 资料采用SPSS 17.0软件统计包分析数据，计量资料数据采用均数±标准差±s）或率（%）表示，多组间均数的比较采用方差分析，如果有差异（P<0.05），则进行多组间的两两比较，统计方法用q检验。多组间率的比较采用行*列表卡方检验；如果有差异进一步的做两两比较，先做分割再用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本情况比较 3组患者的年龄、BMI、不孕年限、基础FSH、基础E2水平及AFC方面均无统计学差异（P＞0.05）。 见表 1。

表1 患者基本情况比较

组别周期数（例）年龄(岁)BMI(kg/m2)不孕年限(年)FSH(U/L)E2(pg/ml)AFC SET组240 30.73±5.15 21.89±2.81 5.50±3.93 7.57±2.94 34.94±19.14 12.83±4.97 SBT组 DET组473 29.80±4.38 21.14±2.72 4.52±3.13 6.39±1.78 36.35±17.73 14.08±5.41 3942 30.25±4.58 21.89±2.96 4.64±3.39 6.68±2.33 42.54±18.35 13.49±4.93

2.2 患者促排卵临床特征比较 3组患者在HCG日内膜厚度、孕酮水平、E2水平、Gn天数、Gn总量、获卵数方面差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 患者临床结局的比较 3组在男女出生性别比、宫外孕率、中重度OHSS发生率、第二个新生儿出生体重方面无统计学差异（P＞0.05）。3组在种植率、临床妊娠率、抱婴率方面，组间两两比较均有统计学差异（P＜0.05）。其中SBT组种植率最高（64.9%），而DET组临床妊娠率 （70.47%）及抱婴率（61.01%）最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 SET组早期流产率（17.76%）显著高于SBT组（7.97%）及DET组（6.84%）。SBT组晚期流产率（2.59%）显著低于 SET组（5.61%）、DET组（4.64%）。DET组多胎妊娠率（46.89%）、剖宫产率（74.59%）、早产率（20.67%）显著高于 SET组 （3.74%，68.92%，4.67%）及SBT组（3.32%，57.36%，7.61%）。DET组孕周（37.64±2.49）、第一个新生儿出生体重（2.93±0.64）、极低/低体重儿率（30.05%）显著低于 SET 组（38.53±1.46，3.32±0.45，2.56%）及 SBT 组（38.60±1.75，3.27±0.51，7.09%）。 DET 组孕期并发症发生率（9.04%）显著高于 SET组（4.67%），以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。 见表 3。

3 讨论

辅助生殖技术给不孕患者带来孕育的希望，但同时多胎妊娠和分娩也给患者带来负担和痛苦。预防和治疗多胎妊娠显得尤为重要，目前预防多胎妊娠的措施有减少移植胚胎的数量，选择性减胎术等策略。无疑，从源头控制的单胚胎移植是优选策略，但是单胚胎移植是否会引起妊娠率降低是大家十分关心的一个问题。

Baruffi等[1]的一项荟萃分析显现，单胚移植（SET）和双胚移植（DET）的继续妊娠率分别是28.3%和44.5%（P＜0.05），活产率分别是28.4%和42.5%（P＜0.05），单胚移植降低了鲜胚移植的继续妊娠率和活产率。新鲜移植周期双胚移植的继续妊娠率是单胚移植的1.64-2.60倍，活产率是单胚移植的1.44-2.42倍。可见，单胚胎移植还是会降低妊娠率。但是单胚胎移植包括单卵裂期胚胎移植和单囊胚移植，随着胚胎培养技术的不断发展及胚胎挑选经验的不断丰富，选择性单囊胚移植可以作为一个既降低多胎风险又保证妊娠率的理想移植策略。

本中心数据显示：SBT组种植率（64.9%）显著高于SET组 (42.92%)及DET组 (52.64%)，这与Criniti等[2]、Styer等[3]、Khalaf等[4]的研究结果一致。DET组临床妊娠率(70.47%)高于SBT组(63.64%)及SET组(44.58%)，这与邹丽等[5]的研究结果一致，故在常规IVF/ICSI治疗中，临床专家一般多选择卵裂期胚胎进行移植。而且延长胚胎体外培养时间将增加胚胎淘汰的风险，囊胚培养也是一个胚胎筛选的过程，在这个过程中，发育潜能差及染色体异常的胚胎不能顺利发育至囊胚阶段，只有质量好的胚胎才能发育至囊胚期[6]。所以囊胚移植不可一概而论，也需要根据患者情况来做个体化选择。SBT组宫外孕率（0）有低于SET组（3.74%）及DET组（1.62%）的趋势。囊胚期胚胎宫外孕率低的原因是在生理状态下，4-8细胞的卵裂期胚胎处于输卵管中，而囊胚期胚胎才迁移至子宫腔内着床，所以移植囊胚期胚胎更符合生理的自然环境，并提高胚胎种植率，降低宫外孕发生率。

表2 患者促排卵情况比较

表2 患者促排卵情况比较

组别周期数（例）HCG日内膜厚度（mm）HCG 日 P（ng/ml）HCG日E2(pg/ml)Gn天数（d）Gn总量（IU）获卵数（n）SET组240 10.52±2.50 0.93±0.42 2404.84±1207.00 11.97±2.26 2392.63±1389.44 14.07±5.61 SBT组 DET组473 11.00±2.60 1.10±0.65 2615.91±1706.90 12.28±2.60 2164.19±991.29 16.56±6.05 3942 10.91±2.88 1.07±1.42 2565.57±1266.12 11.94±2.08 2230.71±1054.65 15.74±5.07

表3 患者临床结局的比较

SBT组中重度OHSS发生率 （1.69%）较DET组（1.85%）有下降趋势，但无统计学意义。囊胚培养需要5-6d的时间，比卵裂期胚胎多了2-3d，这给医生及患者更多的时间观察有无OHSS发生倾向，以便采取更有利于患者的临床决策。OHSS分为早发型和晚发型两种，早发型通常发生在应用HCG后的3-7d内，与卵泡数和雌激素水平密切相关，如果未妊娠，多在10d内缓解，如果妊娠，病情可能会进一步加重或者持续时间延长。晚发型多见于HCG应用后的12-17d，与妊娠尤其是多胎妊娠相关[7]。由于早发型多见于HCG注射后3-7d，D5-D6 d囊胚移植时符合HCG注射第7d，此时如果患者无明显不适，可以选择移植囊胚，这部分患者在新鲜周期能够移植，患者心理接受程度较好。

欧阳冬香等[8]的研究显示，单囊胚移植的多胎妊娠率显著低于双囊胚组和双卵裂期胚胎移植组（0 VS 49.1%，42.9%）。我们的数据也显示：DET组有更高的多胎率及剖宫产率、早产率，孕妇分娩孕周也较SBT组短，新生儿出生体重降低，极低/低体重儿率、孕期并发症发生率均明显增加，差异有统计学意义。这些数据均显示：多胎妊娠将带给患者及家属更大的心理压力及经济负担，母婴健康无法得到保障。多胎妊娠带来的母亲并发症包括：前置胎盘、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、胎盘早剥、妊娠期胆汁淤积综合征、先兆子痫、剖宫产率增加等。多胎妊娠将增加胎儿生长发育受限、早产、低出生体重等风险。早产将增加新生儿一系列严重的并发症，包括颅内出血、呼吸窘迫综合征、坏死性小肠结肠炎、败血症、黄疸和新生儿死亡率增加等。多胎出生将增加一些远期并发症的发生，如先天性心脏病、脑性瘫痪、发育迟缓和学习障碍等[9]。囊胚阶段不适合移植两枚胚胎，单囊胚移植保证了妊娠率，明显降低了多胎发生率，给母婴安全带来了保障。

但是，单囊胚移植策略是否适宜全面推广？它有哪些适用人群？目前在欧洲及澳大利亚许多生殖中心，单胚胎移植已经提倡并实施多年，近年来美国和日本也在积极推进单胚胎移植策略。例如，瑞典政府为了降低多胎出生，法律限制大部分妇女只能单胚胎移植[10]。在芬兰，虽然没有成文的法律条例规定必须单胚胎移植，但是IVF中心对几乎所有患者都推荐单胚胎移植策略[11]。虽然目前美国还没有胚胎移植个数的规定，但是ASRM(American Society for Reproductive Medicine)和SART(Society for Assisted Reproductive Technology)对辅助生殖中心提供了移胚个数指南[12，13]。美国有的生殖中心执行强制性单胚胎移植策略：所有年龄＜38岁无鲜胚周期失败史患者，有≥7个2PN受精卵，有≥1个好的或优质囊胚可供移植。他们单胚胎移植策略明显降低了多胎率 （从35%降到3.4%），并使累积活产率（84%）维持稳定[14]。但是花费的时间和金钱可能会增加。我中心的数据显示：同样是移植单个胚胎，但是SET组的临床妊娠率(44.58%)显著低于SBT组(63.64%)，这与Kawmura等[15]的研究结果一致。由于单囊胚移植在降低多胎妊娠、预防OHSS、维持较高的临床妊娠率方面作用显著，因此，我中心目前采用单囊胚移植策略，它的适用人群是：⑴患者年龄＜38岁；⑵IVF预后良好；⑶疤痕子宫患者；⑷取卵≥15个，HCG日雌激素偏高，体重指数小于20，有OHSS风险的患者，可以为她们多争取48h的时间，认真评估患者耐受性及后期情况后，可以选择单囊胚移植，但不能排除迟发型OHSS风险；⑸有至少4个以上D3优胚。在移植前征得患者意见并签署知情同意书。另外，加强患者宣教及劝导，可以采用医务人员讲课，DVD视频宣教，手册宣教，医护人员和患者一对一、面对面沟通等方法，加强患者对多胎妊娠风险的认知，提高患者对单胚胎移植策略的接受程度。对于多胎妊娠患者，医务工作者也要加强宣教，重视孕期母儿监护和管理，降低母儿并发症发生率，改善不良妊娠结局。

综上所述，选择性单囊胚移植可以明显降低多胎率，并且不影响胚胎种植率，对于年轻，IVF结局预后良好，疤痕子宫或者有OHSS高风险的患者可以尝试选择性单囊胚移植。随着我国计划生育政策的放开，单胎足月分娩的健康新生儿将是我国广大育龄妇女及医务工作者的最佳选择。选择性单囊胚移植策略在不久的将来会得到更广泛的应用。

参考文献

[1]Baruffi RL，Mauri AL，Petersen CG，et al.Single-embryo transfer reduces clinical pregnancy rates and live births in fresh IVF and Intracytoplasmic Sperm Injection(ICSI)cycles：a meta-analysis[J].Reprod Biol Endocrinol，2009，7：36.

[2]Criniti A，Thyer A，Chow G，et al.Elective single blastocyst transfer reduces twin rates without compromising pregnancy rates[J].Fertil Steril，2005，84(6)：1613-1619.

[3]Styer AK，Wright DL，Wolkovich AM，et al.Single-blastocyst transfer decreases twin gestation without affectiong pregnancy outcome[J].Fertil Steril，2008，89(6)：1702-1708.

[4]Khalaf Y，El-Toukhy T，Coomarasamy A，et al.Selective single blastocysttransferreducesthe multiple pregnancyrate and increases pregnancy rates：a pre-and postintervention study[J].BJOG，2008，115(3)：385-390.

[5]邹丽，余敏，黄志辉，等.D3选择性单胚新鲜移植可行性探讨[J].江西医药，2017，52（3）：189-191.

[6]Gardner DK，Vella P，Lane M，et al.Culture and transfer of human blastocysts increases implantation rates and reduces the need for multiple embryo transfers[J].Fertil Steril，1998，69(1)：84-88.

[7]Mathur RS，Akande AV，Keay SD，et al.Distinction between early and late ovarian hyperstimulation syndrome[J].Fertil Steril，2000，73(5)：901-907.

[8]欧阳冬香，伍琼芳，许定飞，等.选择性单囊胚移植技术在辅助生殖技术中的应用[J].江西医药，2015，50（12）：1453-1456.

[9]Tamara T，Fady IS，Jason MF，et al.Promoting the use of elective single embryo transfer in clinical practice[J].Fertil Res Pract.2016，2：1.

[10]Karlstrom PO，Bergh C.Reducingthenumberofembryos transferred in Sweden-impact on delivery and multiple birth rates[J].Hum Reprod，2007，22(8)：2202-7.

[11]Hamberger L，Hardarson T，Nygren KG.Avoidance of multiple pregnancy by use of single embryo transfer[J].Minerva Ginecol，2005，57(1)：15-9.

[12]Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine，Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology.Criteria for number of embryos to transfer：a committee opinion[J].Fertil Steril，2013，99(1)：44-46.

[13]American Society for Reproductive Medicine.Multiple gestation associated with infertility therapy：an American Society for Reproductive Medicine Practice Committee opinion[J].Fertil Steril.2012，97(4)：825-834.

[14]Kresowik JD，Stegmann BJ，Sparks AE，Ryan GL，Van Voorhis BJ.Five-years of a mandatory single-embryo transfer(mSET)policy dramatically reduces twinning rate without lowe ring pregnancy rates[J].Fertil Steril，2011，96(6)：1367-1369.

[15]Kawmura T，Mori M，Arichi A，et al.Elective single embryo transfer[J].Reprod Med Biol，2005，4(3)：197-201.