恩度联合紫杉醇不同给药时序对肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效应观察

吴 芳 陈凤舞 刘方文 纪 巧 王小慧 郭 妮

目前抗血管内皮生成药物——恩度，广泛用于临床，并取得较好疗效。外周血中测得的血管内皮细胞-循环内皮细胞(circulating endothelial cells，0CECs)，可促进肿瘤新生血管的形成且能较好的反应肿瘤患者体内血管生成的状态，可能是1个与预后密切相关的灵敏检测指标。许多研究表明，CECs是1个很好的抗血管生成疗效指标。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c裸鼠32只,4～5周龄,雌性,体重16～18 g,购自南昌大学医学院药物研究所。人肺腺癌A549细胞由南昌大学医学院药物研究所惠赠。恩度15 mg/支，先声药业惠赠，批号:S20050088。紫杉醇，60 mg/支，黄石李时珍药业集团惠赠，批号H20058368。美国Beckman-Coulter 公司流式细胞仪(型号:EPICS-XL IIMCL，科大创新公司 KDC-6000R 低速冷冻离心机，分析系统软件System II)。抗体:大鼠抗裸鼠CD45-PE (CHEMICON公司)。大鼠抗裸鼠CD146-FITC (CHEMICON公司)。同型对照:大鼠FITC-IgG2a(CHEMICON公司)，大鼠IgG2b-PE(CHEMICON公司)，红细胞裂解液及流式液购自美国Beckmancoutler公司。

1.2 方法

1.2.1 建立人肺腺癌A549细胞系动物模型 制备瘤源鼠动物模型:在RPMI-1640培养液中传代培养解冻的人肺腺癌细胞系A549，置于37 ℃、5%CO2的条件下培养，1周后采集细胞，制成浓度约 5×107个/ml的单细胞悬液，接种于裸鼠的双侧鼠蹊部，每侧注射 200 μl。制备荷瘤实验鼠：BALB/c裸鼠32只随机分成4组,每组8只：同时给药组，先恩度给药组，模型组和空白对照组。将制备好的瘤块接种于裸鼠的鼠蹊部,接种3组,共24只，空白对照组8只不接种瘤块。

1.2.2 给药方法 使用注射用水配制恩度注射液，皮下注射；使用生理盐水配制紫杉醇注射液，腹腔注射。

同时给药组:恩度，每天300 μg/只，d1～d35，紫杉醇，30 mg/kg/3天，d1～d19，给药第35天处死。先恩度给药组:恩度，每天300 μg/只，d1～d35;紫杉醇，30 mg/kg/3天，d16～d34。给药第35天处死。模型组：生理盐水，每天100 μl/只，皮下注射，d1、d35；注射用水，300 μl/只/3天，腹腔注射，d1、d35。第35天处死。空白组：给药同模型组。

1.2.3 采血及处死 给药完毕后1天，摘眼球取血。随后以脱颈椎法处死裸鼠。完整剥离瘤组织。

1.2.4 绘制移植瘤生长曲线，计算抑瘤率 每周称裸鼠体重2次。每周测量加药后瘤块的长径a及短径b 2次，按公式(瘤体积V=a×b2/2)计算移植瘤体积，计算每组平均值，绘制移植瘤生长曲线。计算抑瘤率=(1-治疗组体积/对照组体积 )× 100%。

1.2.5 FCM(流式细胞术)检测裸鼠血中aCECs水平 ①取2支流式细胞检测管，分别标记为对照管、实验管，每管加入裸鼠静脉血100 μl。②对照管加入FITC及PE标记的Ig同型对照各1 μl;实验管加入CD45-PE及大鼠CD146-FITC。振荡混匀，常温避光孵育30分钟。③每管加入红细胞裂解液0.5 ml，混匀，避光孵育15 min;滴加流式液至5 ml并混匀，离心5 min(1500转/分钟);除去上清液，加入流式液0.5 ml，振荡混匀，上机检测。④上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2以内，以目标细胞群设门，上机后收集1万个细胞，根据细胞发出的荧光测定表达率并计算CD45-CD146+细胞(aCECs)数。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0进行数据分析。正态分布的计量资料以±s表示。以P<0.05为差异有统计学意义。非正态分布的计量资料以中位数(肘)及四分位数间距(Q)表示，采用秩和检验进行统计。

2 结果

2.1 各组裸鼠治疗前后肿瘤体积比较

同时用药组和先恩度组治疗前后肿瘤体积的差值均低于模型组(P<0.05)，但同时用药组肿瘤增长较慢，与先恩度组比较有明显统计学差异(P<0.05) (图1，表1)。

图1 各组肿瘤生长曲线

2.2 各组裸鼠外周血中CECs数量的比较

同时用药组、先恩度组、模型组和空白对照组裸小鼠外周血中CECs的数量分别为(25.86±11.77)个/104个细胞、(77.25±24.02) 个/104个细胞、(14.71±11.07) 个/104个细胞和(12.90±11.20) 个/104个细胞，同时用药组、模型组和空白对照组均明显低于先恩度组(P均<0.01)，而同时用药组、模型组和空白对照组之间的差异均无统计学意义，见图2。

3 讨论

我国自主研发人重组血管内皮抑素——恩度，与化疗联合取得较好的抗肿瘤治疗效果。但与化疗联合的时序问题目前尚无定论。但也有学者认为，血管正常化只是1个短暂过程，产生的疗效较小，先使用化疗药物大量杀伤肿瘤后，再行抗血管生成治疗才能使患者得到最大获益。因此，比较恩度联合化疗不同给药时序的疗效，为临床制定最佳治疗方案提供依据。

目前抗血管生成类药物的疗效评价尚无明确的生物标志物，评价抗血管生成治疗药物疗效的方法包括内皮细胞的形态学观察(如微血管密度)、肿瘤血管超微结构的观察[1]、血管生成调节剂的检测[2]、彩色多普勒测定血流、间接观察肿瘤大小或肿瘤标志的监测及循环内皮细胞CECs检测，其中CECs检测因取材方便、操作简易且可动态观察其含量变化而成为首选评价疗效方法[3]。大量文献表明CECs可作为肿瘤的生物标记物，其含量与肿瘤进展和预后相关[4]，癌症患者外周血中的CEC含量高于正常人，完全缓解后降至正常[5]。在进展期肿瘤患者中富含活化的CEC，通过促进新生血管生成从而影响肿瘤的演变及转移[6-7]。

表1 第35天各组体积及抑瘤率(±s)

表1 第35天各组体积及抑瘤率(±s)

组别例数瘤体积/mm3疗前疗后差值/mm3P抑瘤率/%同时组88．56±4．5444．88±35．1236．32±30．580．020▲80先恩度组86．42±2．44118．88±74．22112．46±71．780．010△48模型组86．68±2．56221．52±96．13214．84±93．570．002∗

注：▲为同时组与先恩度组差值的比较，△为先恩度组与模型组比较，*为模型组与同时组比较。

图2 各组裸鼠中CECs数量比较

本研究，比较了恩度与紫杉醇不同给药顺序的抗肿瘤效应，同时也探讨了不同给药时序，CECs数量的变化。在抑瘤率方面，同时用药组优于先恩度组，(80% vs 48%P<0.05),与袁静等[8]报道一致。考虑化疗后肿瘤负荷减轻，肿瘤细胞同步化进入处于G0/G1期，随后恩度作用于G0/G1期，诱导细胞产生凋亡。在CECs数量方面，同时用药组和先恩度组较模型组CECs数量明显减少，同时用药组的CECs数量最少，但与先恩度组比较无统计学意义。Wang等[9]发现，在化疗联合恩度治疗非小细胞肺癌有效的患者中，其aCECs水平呈下降趋势。国外类似研究的结果也显示，非小细胞肺癌患者经紫杉醇联合卡铂治疗后，aCECs数量下降[10]。化疗药物的肿瘤杀伤作用强，可迅速减少促血管生成因子(tumor angiogenesis factors，TAFs)，诱导CECs产生凋亡，恩度可以维持此作用，故CECs数量明显降低。

综上，化疗联合恩度，同时应用化疗与恩度，待有效削减肿瘤体积后，再以抗血管生成药物维持治疗。治疗后CECs数量下降则反映了CECs的凋亡和肿瘤消退，其变化可能可以帮助预测疗效。

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