β-榄香烯注射液对人肝癌HepG-2细胞侵袭、迁移的作用及其相关机制

毛雨秋

肝癌恶性程度高、预后差，是消化系统比较多见的恶性肿瘤。手术切除仍是临床治疗肝癌的有效方式之一，但复发率较高[1-2]。术后肿瘤复发、侵袭及转移是影响肝癌患者预后的关键因素。但肿瘤侵袭及转移的机制较为复杂，目前尚未研究确切。据报道[3-4]，基质金属蛋白酶(MMPs)可有效降解胶原原纤维和细胞外基质成分，与肿瘤的侵袭、转移机制具有密切关联。β-榄香烯主要是由姜科植物中提取而来，是一种典型的抗肿瘤成分，体外研究表明，β-榄香烯注射液具有良好的抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞快速凋亡，但其具体作用机制尚不确切[5-7]。本研究旨在探讨β-榄香烯注射液对人肝癌HepG-2细胞侵袭及转移的影响，进一步分析HepG-2细胞侵袭及转移机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝癌细胞株HepG-2，购于中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂及仪器 β-榄香烯注射液(由大连金港制药厂提供，并经南京中医药大学药学院药化实验室鉴定，纯度为99.8%)，DMEM培养基，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)，四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，购于Sigma公司)，Transwell小室(Millipore公司)，胰蛋白酶(Bio SHARP公司)，β-actin(Sigma公司)，兔抗MMP-2/9抗体(Santacruz公司)，羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Bio world公司)；电泳仪(Bio Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG-2细胞培养 以含有10%FBS的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长贴壁达亚融合状态时，以0.25%胰酶消化，备用。

1.2.2 MTT法检测细胞活力 将对数生长期细胞以胰酶消化，配置成细胞悬液，调整细胞悬液浓度为105个/mL，接种于96孔板，100 μL/孔。分别加入浓度为0、10、20、30、50、100、200、400 μg/mL的β-榄香烯注射液处理24 h，各样本设置5个复孔。加入5 μg/mL新鲜配置的MTT溶液20 μL，孵育4 h后吸除上清；然后加二甲基亚砜(DMSO)150 μL/孔，于摇床震荡10 min。以酶标仪测定各孔490 nm下的吸光度(OD490 nm)并详细记录，细胞活力指数=(实验组OD490 nm/阴性对照组OD490 nm)×100%。

1.2.3 细胞-基质粘附实验检测细胞粘附能力 将对数生长期的细胞接种于6孔板，106个/孔，分别以浓度为0、10、20、30 μg/mL的β-榄香烯注射液处理24 h后，以含10% FBS的培养液重悬，接种于预先铺好Matrigel基质胶的96孔板中，104个/孔，各孔设置3个复孔，继续培养1 h。然后以甲醇固定粘附细胞15 min，加入0.1%的结晶紫染色液，清洗，风干，以0.2% TritonX-100溶解，采用酶标仪测定各孔550 nm下的吸光度(OD550 nm)并详细记录。细胞粘附率=(实验组550 nm/阴性对照组OD550 nm)×100%。

1.2.4 Transwell迁移/侵袭实验检测HepG-2细胞的侵袭及迁移情况 细胞样本的分组及给药方式同上。处理24 h后用无血清培养液调整细胞浓度为5×105个/mL，取200 μL细胞悬液加至Transwell上室，另取600 μL含20% FBS的培养基加入Transwell下室，24 h后取出Transwell小室，经PBS洗3次，以棉签擦去上室未穿过去的细胞，加入甲醇固定15 min，PBS洗3次，加0.1%的结晶紫染液，30 min后以自来水洗涤，于倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况，拍照并记录，计算HepG-2细胞的迁移抑制率。侵袭实验的方法与迁移实验相似，不同之处是在上室加入50 μL 1∶8比例稀释过的Matrigel基质胶。于倒置相差显微镜下观察细胞侵袭情况，拍照并记录，计算HepG-2细胞迁移、侵袭抑制率，抑制率=(对照组-实验组)迁移、侵袭细胞数量/对照组迁移、侵袭细胞数量×100%。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测MMP-2及MMP-9基因的表达情况 细胞样本的分组及给药方式同上。处理24 h后提取细胞蛋白，经BCA法检测蛋白浓度并调节一致。取50 μg蛋白上样(β-actin为内参)，以用10%的分离胶及5%的浓缩胶进行SDS PAGE电泳，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，以封闭液在室温下封闭1 h，加入一抗(兔抗MMP-2/9抗体，工作浓度为1∶1 000)，4 ℃下孵育过夜，TBST洗膜3次，10 min/次，随后加入二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，工作浓度1∶5 000)，室温摇床上缓慢摇动1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，发光液发光后，凝胶成像仪下扫描拍照。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，进行t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测β-榄香烯注射液对HepG-2细胞活力的影响

MTT检测结果显示，当β-榄香烯注射液浓度为50、100、200及400 μg/mL时，HepG-2细胞活力明显降低，且HepG-2细胞的活力随β-榄香烯注射液浓度的增大而明显降低(P<0.05)，具有浓度依赖性。见图1。因此本研究选取β-榄香烯注射液浓度0、10、20、30 μg/mL，以排除高浓度β-榄香烯注射液对HepG-2细胞增殖活性的影响，而进行后续实验。

图1 MTT检测β-榄香烯注射液对HepG-2细胞活力的影响

2.2 β-榄香烯注射液对HepG-2细胞粘附能力的影响

细胞-基质粘附实验结果显示，随着β-榄香烯注射液浓度的增大，HepG-2细胞的粘附率明显降低(P<0.05或P<0.01)。见图2。

图2 β-榄香烯注射液对HepG-2细胞粘附能的影响

2.3 β-榄香烯注射液对HepG-2细胞侵袭及迁移能力的影响

Transwell迁移及侵袭实验结果显示，随着β-榄香烯注射液浓度的加大，HepG-2细胞侵袭及迁移数量逐步降低，且β-榄香烯注射液浓度为20、30 μg/mL的HepG-2细胞迁移及侵袭细胞数量明显降低，而迁移及侵袭抑制率显著升高(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.4 β-榄香烯注射液对HepG-2细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

Western blot实验显示，随着β-榄香烯注射液浓度的加大，MMP-2及MMP-9蛋白表达量均逐渐降低，且对MMP-2蛋白表达的抑制作用更为显著。见图3。

3 讨论

肝癌是目前导致人类死亡的主要恶性肿瘤之一，其中肿瘤细胞的侵袭及迁移是导致癌症患者死亡的主要原因。β-榄香烯是从姜科植物温莪术中提取的萜烯类化合物。早在上世纪70年代就发现莪术挥发油对局部治疗宫颈癌效果显著。近年来研究发现，β-榄香烯是温莪术抗肿瘤作用的主要有效成份，其具有广谱抗肿瘤作用，疗效确切且毒副作用轻微，目前在临床广泛用于肺癌、恶性浆膜腔积液、消化道肿瘤、脑瘤或其它浅表性肿瘤的治疗[8-9]。但有关β-榄香烯注射液抗肿瘤的作用机制尚不确切，本研究主要探讨β-榄香烯注射液对HepG-2细胞侵袭及迁移能力的影响，探讨其抗肿瘤机制。

本研究中体外基础实验证实，β-榄香烯注射液对HepG-2细胞增殖活性具有明显的选择性抑制作用，其中当β-榄香烯注射液浓度为50、100、200及400 μg/mL时，HepG-2细胞活力明显降低，且HepG-2细胞活力随β-榄香烯注射液浓度的增大而明显降低，具有浓度依赖性，因此本研究选取β-榄香烯注射液浓度为0、10、20、30 μg/mL，排除高浓度β-榄香烯注射液对HepG-2细胞增殖活性的影响。粘附是HepG-2肿瘤细胞侵袭的开始，肿瘤细胞表面特定的受体可与正常细胞基膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原蛋白等粘连，在蛋白水解酶及相关因子的作用下，侵袭基膜，降解细胞外基质，进行快速侵袭性生长并发生转移[10]。本研究中通过细胞-基质粘附实验结果显示，随着β-榄香烯注射液浓度的增大，HepG-2细胞的粘附率明显降低，提示β-榄香烯注射液可有效降低HepG-2细胞的粘附能力，阻碍其后续的侵袭及转移。此外，本研究中采用与天然基膜极为相似的基质胶铺在Transwell小室膜上，进行Transwell小室侵袭及迁移实验，形象地在体外模拟肿瘤细胞侵袭、迁移过程，结果显示，HepG-2细胞侵袭及迁移数量随β-榄香烯注射液浓度的增加而呈逐渐降低趋势，且当浓度为20、30 μg/mL时HepG-2细胞迁移及侵袭细胞数量明显降低，而迁移及侵袭抑制率显著升高。提示β-榄香烯能有效地降低HepG-2肝癌细胞侵袭和迁移的能力，且呈剂量依赖性，与相关研究[11]结果相似。

表1 β-榄香烯注射液对HepG-2细胞增殖的影响

与0 μg/mL比较，*为P<0.05，**为P<0.01；##为与10 μg/mL比较，P<0.01。

图3 β-榄香烯注射液对HepG-2细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

肿瘤细胞侵袭及转移是一个复杂的、连续的多步骤的过程，也是导致肿瘤患者恶性程度升高的关键。肿瘤细胞具有从原发部位迁移并进行增殖的能力，其不仅与肿瘤细胞自身改变有关，也与宿主微环境与肿瘤细胞间的相互作用有关[12]。MMPs是参与细胞外基质和基膜降解的蛋白水解酶，其中MMP-2及MMP-9是典型的MMPs，HepG-2细胞中MMPs的结构功能及水平的变化与HepG-2细胞侵袭及迁移密切相关。本研究中Western blot实验结果显示，随着β-榄香烯注射液浓度的加大，MMP-2及MMP-9蛋白表达量均逐渐降低，且对MMP-2蛋白表达的抑制作用更为显著，提示β-榄香烯注射液可明显减少细胞外基质和基膜的降解，降低肝癌细胞侵袭和转移的能力。

综上，β-榄香烯注射液可显著降低肝癌HepG-2细胞的粘附能力，并抑制其侵袭及迁移，其作用机制很可能与其明显下调机体MMP-2、MMP-9蛋白表达相关，但具体的抗肝癌作用机制仍需临床进一步深入研究。

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