非小细胞肺癌环状RNA表达谱的差异分析

张韶岩 曾小莉 郭琳 区颂雷 马旭晨

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居常见恶性肿瘤的第2位，病死率居癌症死亡原因首位[1-2]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占所有肺癌的80%，主要的病理类型是腺癌和鳞癌。探索NSCLC的生物学特征和发病机制，寻找诊断NSCLC的分子标志物是目前的研究热点[3-4]。环状RNA(circular RNA, circRNA)是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种新的内源性非编码RNA分子，呈封闭环状，比线性RNA更稳定，具有一定的保守性、组织和疾病特异性[5]。研究发现circRNA的表达异常与肿瘤的发生发展、侵袭转移及放疗耐受有着密切联系，因此circRNA在肿瘤诊断和治疗方面具有广阔的应用前景[6-11]。但目前尚无NSCLC肿瘤组织中circRNA表达情况的相关研究。本研究应用circRNA芯片技术，对NSCLC组织与对应癌旁组织中差异表达的circRNA进行筛选，为进一步研究circRNA在NSCLC发生发展中的作用提供实验依据。

资料与方法

一、一般资料

收集2016年10至11月于首都医科大学附属北京安贞医院进行手术的NSCLC患者病理组织标本3例，其中男2例，女1例，年龄58～67岁，平均年龄63岁；根据病理诊断，肺腺癌2例，肺鳞癌1例；根据TNM分期，Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期1例。组织标本分别取自NSCLC原发肿瘤组织、距肿瘤边缘≥5 cm的癌旁组织，共6组取标本后立即置于液氮中速冻，然后转移到-80 ℃冻存。本研究符合本院伦理委员会的医学伦理要求。

二、纳入标准及排除标准

纳入标准：①年龄大于18岁；②经病理组织检查确诊为NSCLC者；③手术治疗前血常规、肝肾功能、心电图检查达治疗要求；④手术治疗前无严重合并症。排除标准：①无病理学诊断，TNM分期不详；②手术前接受过化疗或放疗；③存在其他肿瘤；④患者依从性差，不能配合研究者。

三、研究方法

1. 标本总RNA的提取： 按照TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明，分别提取3例NSCLC患者癌组织与对应癌旁组织中的总RNA，首先测定提取的RNA在260、280、230 nm处的吸光度值，计算浓度并估算纯度。然后采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法检测RNA的纯度及完整性。

2. circRNA芯片检测： ①cDNA合成和标记：首先使用RNaseR (Epicentre公司，美国)除去标本总RNA中的线性RNA，然后采用Super RNA Labeling(Arraystar公司，美国)方法对RNA进行cDNA扩增和荧光标记；② 芯片杂交：首先将标记后的样品与Human circRNA Array V2(8×15K)芯片(Arraystar公司，美国)进行排列杂交，然后用清洗液试剂盒(Agilent公司，美国)进行清洗。由上海康成生物公司提供circRNA芯片检测、图像采集、数据分析等。

三、数据分析

应用G2505C基因芯片扫描仪(Agilent公司，美国)扫描各标本Cy3荧光强度，然后采用Agilent Feature Extraction software (version 11.0.1.1)进行数据分析，并且使用R软件包对数据进行归一化处理。根据癌组织样本和癌旁组织样本间circRNA的变化倍数和P值筛选差异表达的circRNA，以变化倍数>2倍，配对t检验P值<0.05为阳性结果。对芯片筛选出的差异表达circRNA作进一步数据分析包括层次聚类分析、绘制散点图和火山图。通过TargetScan[12]和miRanda[13]两个软件对每种差异circRNA分别预测其最可能结合的miRNA，取匹配值较高的5个miRNA，并对这5个miRNA的结合位点进行预测和注释。

结 果

一、总RNA的质量分析

6组标本中提取的RNA的D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8～2.0之间，D(260 nm)/D(230 nm)>1.8。电泳图显示总RNA的28 s、18 s条带清晰，且28 s条带亮度是18 s的2倍以上，5 s 条带模糊。结果表明提取总RNA的质量与纯度符合要求，可用于下一步实验分析，见图1。

图1 组织样本的总RNA 电泳图；注：1～3： 非小细胞肺癌肿瘤组织；4～6： 癌旁组织

二、利用盒型图分析原始样本中circRNA表达情况

所有标本的芯片数据经过归一化处理后，使用盒型图可以直观了解到circRNA表达分布情况在6组标本中几乎是相同的，可进行下一步数据分析，见图2。

图2 3例非小细胞肺癌癌组织(C)与对应癌旁组织(A)中circRNA表达情况；注：C1～C3： 非小细胞肺癌组织；A1～A3： 癌旁组织

三、层次聚类分析

按照各组标本circRNA表达量的高低不同进行监督性层次聚类分析，从而将各组标本进行分类。图中红色表示circRNA表达量相对高，绿色表示circRNA表达量相对低，显示差异表达的circRNA能将癌组织与癌旁组织区分开来，见图3。

图3 3例非小细胞肺癌癌组织(C)与对应癌旁组织(A)差异表达的circRNA层次聚类分析；注：C1～C3： 非小细胞肺癌组织；A1～A3： 癌旁组织

四、差异表达的circRNA图形分析

对筛选出差异表达的circRNA进行图形分析，绘制散点图和火山图。散点图表示癌组织和癌旁组织circRNA总体分布集中趋势，图中分布于line1上方和line3下方的circRNA差异倍数达2倍以上，且有统计学意义(P<0.05)，分别表示circRNA表达上调和表达下调的分布情况，见图4。

图4 非小细胞肺癌癌组织与癌旁组织差异表达的circRNA 绘制的散点图；注：线1(line 1)上方和线3(line 3)下方散点代表的circRNA差异倍数达2倍以上且P<0.05

采用火山图进行差异表达circRNA的筛选，图中红色区域代表circRNA的差异倍数达2倍以上，且有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 非小细胞肺癌癌组织(C)与癌旁组织(A)差异表达的circRNA 绘制的火山图；注：红色区域代表的circRNA差异倍数达2倍以上且P<0.05

五、差异表达的circRNA

比较癌组织及癌旁组织中circRNA的变化倍数和P值，筛选出差异表达2倍以上且具有统计学意义的circRNA共171种，其中高表达的有148种，表达差异达3倍以上的37种；低表达的有23种，表达差异达3倍以上的有2种，见表1，表2。每种差异circRNA分别预测出其结合匹配值较高的5个miRNA，见表3。

表1 癌组织相对癌旁组织上调表达差异3倍以上的circRNA

表2 癌组织相对癌旁组织下调表达差异3倍以上的circRNA

表3 差异表达的circRNA 的miRNA 结合位点

讨 论

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是一类不具备编码蛋白功能的RNA转录本，包括微小RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和circRNA等[14-16]。ncRNA曾经被认为是基因无用的噪音，然而近年来研究表明ncRNA在表观遗传学、转录调控及转录后调控中发挥重要作用[17]，特别是在肿瘤的发生、发展、转移及预后等方面扮演重要角色[18]。Peng等[19]综述了目前与肺癌相关的16种lncRNA的功能及其作用机制，提示lncRNA有可能作为肺癌有效的生物学标志物，并提供新的治疗靶点。

circRNA是一种特殊的内源性ncRNA，随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展， circRNA的研究已逐渐从零星到系统化，成为目前RNA研究的热点。circRNA能够作为miRNA海绵，通过与miRNA结合来阻碍miRNA与mRNA靶点结合，进而抑制miRNA功能[20]，或者参与调节miRNA，降低miRNA的活性，从而在miRNA调控的疾病中发挥重要作用[21-22]。本研究对NSCLC筛选出的每种差异circRNA分别预测出其结合匹配值较高的5个miRNA，这些circRNA是否能通过结合相关miRNA的结合位点，从而影响NSCLC的发生发展尚有待进一步研究。

近年来国内外研究证实circRNA在人类肿瘤中表达异常，研究报道在喉癌中发现了698种表达量明显变化的circRNA[6]，Sand等[23]在基底细胞癌中发现了23个高表达和48个低表达的circRNA。Li等[7]应用两个circRNA公共数据库资源筛选出目标circRNA(hsa-circ-002059)，发现其在胃癌中异常低表达，与癌症远处转移情况、TMN分期、性别及年龄呈显著相关。Wang等[8]发现circRNA(hsa-circ-001988)在结肠癌组织中低表达，且表达水平与结肠癌细胞分化和嗜神经侵袭显著相关。Shang等[9]发现circRNA(hsa-circ-0005075)在肝癌组织中呈高表达，并与肿瘤大小显著相关。研究表明circRNA在食管癌中表达量异常[10-11]，circRNA ITCH可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而对食管癌和肺癌有抑制效应[24-25]。但目前尚无NSCLC肿瘤组织中circRNA表达情况的研究报道。

本研究采用高通量circRNA芯片对NSCLC癌组织与癌旁组织的表达谱变化进行筛选，结果发现差异表达的circRNA共有171种，高表达的circRNA有148种，低表达的有23种，其中高表达差异3倍以上的37种，低表达差异3倍以上的有2种。初步分析差异表达的circRNA具有miR-21、miR-22、miR-29、miR-129、miR-143、miR-150和miR-200的潜在位点，大量研究证实这些miRNA在NSCLC发生发展中发挥重要调控作用。我们前期研究发现NSCLC患者外周单个核细胞中miR-143表达显著降低，miR-150在肺腺癌中表达量明显高于肺鳞癌，提示miR-143、miR-150与NSCLC相关，有可能作为鉴别诊断NSCLC的分子标志物[26]。本研究发现hsa_circRNA_100352在癌组织(相对于癌旁组织)中显著上调，hsa_circRNA_102062在癌组织(相对于癌旁组织)中显著下调，分别具有miR-143和miR-150的潜在位点，并且这两种circRNA都是外显子circRNA。本研究还对circRNA上的保守miRNA的结合位点进行预测分析，推测hsa_circRNA_100352和hsa_circRNA_102062可能通过与miR-143和miR-150结合来调控靶基因的表达，在NSCLC的发生发展中可能发挥重要作用。但是，由于本筛选研究标本数量较少，有其局限性，还需要大样本的临床验证研究和基础研究加以证实。进一步探讨目标circRNA与NSCLC病理类型、分期和转移的关系，深入研究目标circRNA参与NSCLC发生发展的过程及其作用机制，可为NSCLC的早期诊断、靶向治疗以及预后判断提供新的思路。

参 考 文 献

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