莠去津降解菌的筛选及其降解特性研究

冯瑞章，杜永华，魏琴，周万海，何飞，黄彭，李莉

1(宜宾学院 生命科学与食品工程学院学院，四川 宜宾，644000) 2(固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾，644000)

莠去津(atrazine)化学名称为 2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5- 三嗪，是一种可有效防除阔叶杂草和禾本科杂草的选择性内吸传导型除草剂[1]。目前已被欧盟等国家禁用，但在我国西南地区，莠去津与其他农药的混用品仍然作为玉米、高粱、水稻等农作物的主要除草剂[2]。莠去津为农业发展带来巨大经济效益的同时，导致土壤、地表水、地下水、空气等严重污染，环境和食物链中的莠去津对人类和动物生殖系统、内分泌系统、淋巴系统等有极大的不利影响，是潜在的致癌物质[3]。目前，莠去津的矿化、生物降解已受到广泛关注。研究表明，包括Pseudomonas(假单孢菌)、Bacillus(杆菌)、Acinetobacter(不动杆菌)、Agrobacterium(土壤杆菌)、Arthrobacter(节细菌)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌)等的微生物能以莠去津为碳源、氮源及能源物质对其进行降解[4-6]。

近年来，随着包括莠去津等除草剂的大量使用，以植物产品(小麦、玉米、高粱、大米和糯米)为主要原料，以水源、大气、生态环境条件为主要影响因子的白酒品质受到严重影响，对外贸易受到严格限制。食品在发酵过程中，微生物对农药残留具有明显的降解作用[7-8]。课题组在前期研究中，通过对白酒糟醅进行喷施莠去津，诱导分离得到28株微生物菌株，本文以此为材料，筛选高效莠去津降解菌株，研究其降解莠去津的能力和性能，为莠去津降解菌的应用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及药剂

供试菌株为经莠去津农药诱发、富集培养后分离自浓香型白酒糟醅的28株细菌(分离于2016年9月)，保存于宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室。莠去津质量分数(99%)原药，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 培养基

纯化培养基(g/L)：蛋白胨5，胰蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖10，MgSO4·7H20 0.03，CaCl2·2H2O 0.003；蒸馏水1 000 mL；pH 6.0～6.2。

基础培养基(g/L)：K2HPO42.4，KH2PO41.2，NH4NO31，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.025,Fe2(SO4)30.008；蒸馏水1 000 mL；pH 6.0～6.2。

综上所述，我院采取综合干预措施，使清洁手术围手术期预防使用抗菌药物趋于合理规范，综合干预措施有力，成效明显。

1.2 方法

1.2.1 莠去津降解菌株筛选及降解能力测定[6]

将28株纯化、编号后的供试菌株接种于含有100 mg/L莠去津原药的固体基础培养基上，30 ℃培养72 h，转代培养于莠去津质量浓度为200 mg/L的培养基，30 ℃培养72 h，继续转代3次，至培养基中莠去津质量浓度增至500 mg/L时还能生长的菌株，即为具有莠去津降解潜能的菌株。

将筛选到的具有莠去津降解潜能的菌株制备菌悬液(菌数约为109个/ mL)，按2%的接种量接种于50 mL莠去津质量浓度为200 mg/L的基础培养基中，黑暗摇床培养(30 ℃，160 r/min)72 h，连同菌体转入250 mL分液漏斗中，用60 mL二氯甲烷萃取3次，下层有机相经无水硫酸钠合并于250 mL平底烧瓶中，置旋转蒸发仪(35 ℃)上减压浓缩至近干，氮气吹干后用色谱甲醇定容至10 mL，高效液相色谱(HPLC)测定莠去津的残留量[9]，检测波长220 nm，流动相V(甲醇)∶V(水)=55∶45，流速1 mL/min，进液量20 μL。

降解率%=

每株菌3次重复，以不接种为对照。

1.2.2 菌株生长动态和莠去津降解动态

将莠去津降解能力较高的菌株制备菌悬液，按2%的接种量接种于50 mL莠去津质量浓度为200 mg/L的基础培养基中，黑暗摇床培养(30 ℃，160 r/min)，分别在0、12、24、48、72、96、120 h时取样，测定培养液的OD600值和残留的莠去津，每株菌3次重复，以不接种为对照。

1.2.3 共代谢物对菌株降解莠去津能力的影响

在50 mL莠去津质量浓度为200 mg/L的基础培养基中，分别加入0.5%的不同碳源(柠檬酸钠，丁二酸，葡萄糖，蔗糖)，调节pH值为6，黑暗摇床培养(30 ℃，160 r/min)72 h，测定培养液中残留的莠去津，每株菌3次重复，以不加共代谢物为对照。

1.2.4 环境条件对菌株降解莠去津能力的影响

在莠去津质量浓度为200 mg/L的基础培养基中，通过分别改变接种量(0.1%、0.5%、1%、2%、5%)、莠去津质量浓度(25、50、100、200、500 mg/L)、培养温度(20、25、30、35、40 ℃)、pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和装液量(25、50、75、100、125 mL)，在其他条件不变的情况下，黑暗摇床培养(30 ℃，160 r/min)72 h，测定培养液中残留的莠去津，每株菌3次重复，以不接种为对照。

2 结果与分析

2.1 莠去津降解菌的筛选

对前期分离保存的28株细菌在不同浓度的莠去津平板上进行传代培养，发现10株菌能以莠去津为唯一碳源和能源在质量浓度为500 mg/L的培养基上生存，占到总供试菌株数量的18.9%，说明这些菌株对莠去津有较高的耐受能力和降解的潜能。

通过液体培养对筛选到的10株菌进行液相色谱检测和莠去津降解率的计算，由图1可知，菌株对莠去津的降解能力存在较大差异，其中降解率大于30%的有4株菌(XQB-1、XQB-21、XQB-25、XQB-33，降解率分别为38.1%、34.6%、37.3%和41.1%)，降解率为20%～30%和小于20%的分别有4株菌(XQB-4、XQB-11、XQB-15、XQB-24)和2株菌(XQB-13、XQB-36)。在10株菌中，XQB-33的降解率最高(41.1%)，是降解率最低菌株XQB-33(13.3%)的3.1倍。为进一步挖掘莠去津降解菌的功能，选取降解率大于30%的4 株菌研究其降解性能。

图1 菌株的莠去津降解率
Fig.1 The atrazine degradation rate of strains

2.2 菌株生长动态和莠去津降解动态

微生物可利用莠去津作为碳源、氮源，通过使底物发生脱烷基、脱N-烷基、三氮环开裂等释放出CO2而发生彻底矿化降解[10-11]。4株菌的生长动态和莠去津降解动态结果表明(图2)，在培养前期(0～24 h)，4株菌生长均较缓慢，几乎没有降解莠去津的能力，随着培养时间的延长，菌体生长速度加快，莠去津的降解率也逐渐升高，在72 h时，4株菌的生长达到对数生长期，莠去津的降解率亦达到峰值，随后各菌株的OD600值和降解率逐渐降低，表明4株菌的生长和功能发挥趋于同步。

图2 菌株生长动态(A)及莠去津降解动态(B)
Fig.2 The dynamics of growth(A) and degradation rate(B) of strains

2.3 共代谢物对菌株降解莠去津能力的影响

微生物共代谢作用是农药发生降解的重要代谢机制[12]。由图3可知，加入共代谢物葡糖糖和柠檬酸钠后，4菌株的莠去津降解率均有不同程度的提高，特别是添加葡萄糖后，XQB-1的降解率由37.9%提高到53.1%，XQB-33的降解率由46.6%提高到60.7%；添加共代谢物蔗糖和丁二酸后，除XQB-1的莠去津降解率略有下降外，其他3菌株都有一定提高，表明共代谢物的添加对菌株降解莠去津的能力有一定促进作用。

图3 共代谢物对菌株降解莠去津的影响
Fig.3 Effects of co-substrates on degradation rate of strains

2.4 环境条件对菌株降解莠去津能力的影响

将供试的4菌株通过分别改变接种量、莠去津浓度、培养温度、培养基初始pH值和装液量，在其他条件不变的情况下，培养72 h，测定菌株的莠去津降解率结果见图4。

图4 环境条件对菌株降解莠去津能力的影响
Fig.4 Effects of environmental conditions on degradation rate of strains

随着培养基中接种量的增加，4株菌的莠去津降解率均呈现先增加，后降低的趋势，且都在接种量为2%时莠去津降解率最高，说明2%的接种量为最适接种量(图4-A)。可能是由于随着接种量的增加，菌体数量增多，在培养前期，培养液能为菌体生长提供足够的营养物质；但是到了培养后期，随着菌种的大量繁殖，培养液所提供的营养物质逐渐被消耗，抑制了菌体生长及降解酶的产生和莠去津的降解。

底物浓度对4菌株降解能力具有较大的影响(图4-B)。XQB-21和XQB-25均在莠去津质量浓度为100 mg/L时的降解率最高，分别为33.6%和35.9%，XQB-1和XQB-33则在莠去津浓度为200 mg/L时的降解率最高，分别为37.9%和46.5%，说明低浓度时，莠去津浓度增加对菌株的降解能力具有促进作用，高浓度的莠去津则对菌株的降解能力具有抑制作用。

由图4-C可知，4菌株对莠去津的降解能力随培养温度的升高呈先上升后下降的趋势，30 ℃是4菌株的最适培养温度，在20～30 ℃范围内，降解率随温度的升高而增加，在30 ℃时，4菌株的降解能力均达到最大；30 ℃后，降解率随温度的升高而减少，40 ℃的高温下培养，XQB-21和XQB-25的培养液会伴有菌体沉淀产生，在生长量上表现负增长，表明这2株菌不能够在高温下长时间的生存。

在同一规格和型号的150 mL三角瓶中添加不同体积的培养基，依培养基体积按比例接种4株降解菌，考察装液量对其降解率的影响(图4-D)。在不同的装液量下，4株菌都有一定的降解莠去津能力，说明它们均不是专性好氧或专性厌氧微生物。XQB-1和XQB-33在装液量为100 mL时表现最高的降解率，XQB-21和XQB-25在装液量为75 mL时表现最高降解率，且装液量为125 mL时的降解率明显高于25 mL和50 mL装液量时的降解率，说明这些菌株对氧的敏感性不高，能够在相对缺氧的环境中生存并发挥较强的降解莠去津能力，这可能与菌株来源有关。

培养基的初始pH值条件对微生物的生长和莠去津的降解有很大的影响(图4-E)。当培养基的初始pH值为8和9时，培养72 h离心后发现基本无菌体，说明偏碱条件不适宜降解菌的生长。当初始培养基pH值小于等于7时，各菌株降解莠去津的能力才有明显增加，菌株XQB-1和XQB-21在pH值为5的培养基中降解率最高，分别为37.9%和34.1%，XQB- 25和XQB-33在pH值为6的条件下降解率最高，分别为35.4%和49.7%；当pH值为3时，4菌株的降解率又较最高降解率降低了13.8%～24.38%，表明这4株菌适宜在偏酸环境生长，可能跟菌株来源于白酒糟醅的酸性环境有关。

3 讨论

微生物降解是环境中残留莠去津的主要降解方式。细菌由于其生理生化的多种适应能力及易诱发突变菌株，在降解莠去津的微生物中占有重要地位。目前，已筛选出各类能够矿化莠去津的降解菌，例如Nocardioidessp.DN36菌株经过56 d可完全降解莠去津[13]，Arthrobactersp.GZK-1降解莠去津需要14 d[14]。本研究通过富集培养，从浓香型白酒糟醅中初筛到10株具有降解莠去津潜能的菌株，液相色谱检测结果显示，这些菌株的莠去津降解率为13.3%～41.4%，其中4株菌(XQB-1、XQB-21、XQB-25、XQB-33)的降解率超过30%。

4株菌的生长动态和莠去津降解动态结果表明，培养72 h时，4株菌的生长达到对数生长期，莠去津的降解率达到峰值，随后菌株的OD600值和莠去津降解率均随培养时间的延长而降低。微生物降解莠去津的实质是降解酶作用下的酶促反应过程[15]，在培养初期，菌株要适应莠去津农药环境，并诱导体内降解酶的生成，因此，菌体数量和降解率均较低；随着菌体数量的增加，降解酶产生量亦逐渐增加，当培养时间达到72 h时，菌体数量和降解酶产量达到最高值，降解率随之达到峰值；培养后期，细菌生长变缓，菌体细胞进入衰亡期，部分被菌体细胞吸收的莠去津被逐渐释放出来，导致72 h后莠去津的降解率逐渐下降。

微生物可通过生长代谢将农药作为碳源或氮源加以利用和分解，亦可通过共代谢方式利用其他底物获取大部分或全部的碳源和能源，改变农药的化学结构使其降解[16]。加入共代谢物可以提高菌株降解莠去津的能力，特别是葡萄糖的添加可使菌株的莠去津降解率大幅升高[17]。

本研究中，供试4菌株对莠去津的最适降解条件为接种量为2%、莠去津质量浓度100～200 mg/L、培养基初始pH值为5～6、培养温度为30 ℃、装液量为75～100 mL/150mL。说明微生物对莠去津的降解，除与菌株自身的属性和莠去津的性质外，还受环境条件如培养温度、接种量、pH值等的影响[18]。

目前，虽然从环境中获得了许多可降解莠去津的各类真菌和细菌，但对各类微生物降解过程中所涉及的中间代谢产物、酶及相应的基因的研究并不深入。因此，从环境中富集分离莠去津高效降解微生物和研究其降解机理都是今后的主要研究方向。