鲢鱼重组Cystatin及其酶解产物对草鱼冷藏肉片优势腐败菌的抑制作用

杨娟，钟海霞，李树红，白稚子，林灵，李美良，刘明宇，林昊

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors，CPIs)，又称巯基蛋白酶抑制剂，英文简称Cystatins，是一类专门抑制活性中心含有半胱氨酸残基(CySH)的蛋白酶水解作用的可逆抑制因子[1]。许多学者已从动植物的组织和体液中分离到Cystatins蛋白，并形成了非常庞大的Cystatins超家族。Cystatins超家族根据结构特征主要分为Stefin(家族I)、Cystatin(家族II)和Kininogen(家族III)3个家族。CPIs在生物防预[2]、免疫应答与调节[3-4]、癌症抑制[5]、细胞凋亡[6]、肿瘤侵袭与转移[7]以及抑菌[8-10]等生理和病理的过程中发挥着重要的作用。

目前对于陆生哺乳动物来源的Cystatin(家族II)研究得比较透彻，但鱼类来源的Cystatin(家族II)很可能具有某些特殊的性质或活性。目前仅从部分鱼组织中纯化出分子质量在12～14 ku的Cystatin，经鉴定均存在Cystatin的保守活性位点[11-12]或典型抑制活性特征[13-14]。此外，尽管部分鱼源Cystatin已得到克隆[15]或表达[16-17]，但研究人员尚未对其生物学活性进行深入系统的研究。

关于Cystatin(家族II)的抑菌作用已有报道，某些陆生动物及植物来源的Cystatin(家族II)均对不同种类的细菌[10, 18]或真菌[19-20]表现出明显的抑制活性，但是关于鱼类Cystatin(家族II)的抑菌作用鲜有报道，仅报道鲤鱼(Cyprinuscarpio)和香鱼(Plecoglossusaltivelis)的受精卵膜提取物(其中含有Cystatin抑制活性)对病原菌表现出抑制作用[21]。此外，本团队陈海[22]等人通过滤纸片法，证明鲢鱼重组Cystatin(家族II)能抑制铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC27853)的生长。但该蛋白对其他常见肉类致腐微生物的抑菌活性仍有待进一步开展。有研究表明，动物来源的Cystatin肽链结构的内部，可能存在抑菌序列[23-25]。鱼类Cystatin(家族II)肽链内部是否存在类似机制，尚未见报道。

为此，本实验拟通过分析鲢鱼重组Cystatin(家族II)的Papain酶解物，对草鱼冷藏肉片中分离的3种优势腐败菌的抑菌效果，同时结合电泳、液相、质谱等分离鉴定方法，以期对Cystatin内部可能含有的有效抑菌片段进行分析和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲢鱼重组Cystatin蛋白冻干粉，参照陈海等[22]的方法由本实验室制备，纯度90.27%，比活性4 130.58 units/mg，分子质量约为20.9 ku。

木瓜蛋白酶(Papain，P4762，10 U/mg)，美国Sigma公司，参照钟海霞[26]的方法，Papain的纯度为95.23%，比活性1.28×105units/(g·min)。

草鱼冷藏肉片优势腐败菌种：草莓假单胞菌(Pseudomonasfragi)、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和中间气单胞菌(Aeromonasmedia)，参考钟海霞[26]的方法分离筛选。

蓝葡聚糖-2000、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe、细胞色素、乳链菌肽、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、γ-球蛋白，美国Sigma公司；凝胶制备试剂盒，博士德生物(武汉)有限公司；低分子质量蛋白标准品(4.6～45 ku，9.5～66 ku)，美国BBI公司；IPG预制胶条pH 3～10,美国Bio-Rad公司。

1.2 仪器与设备

LC-2010HT高效液相色谱系统，日本岛津公司；SW-CJ1F无菌操作台，佳宝进化工程设备(苏州)有限公司；LRH-250生化培养箱，一恒科学仪器(上海)有限公司；JY-ECP3000电泳仪，六一(北京)仪器厂；Mini PROTEIN 3垂直电泳槽、PROTEAN i12等电聚焦系统，美国Bio-Rad公司；Orbitrap Fusion Mass Spectrometer质谱分析仪，美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 Papain酶解鲢鱼重组Cystatin

Cystatin与Papain按1∶0.25质量比均匀混合，加入到酶解反应管中，并标记为Cystatin与Papain反应0、6、12、18、24 h的反应管，其中0 h反应管以水代替Papain，而对照管加入相对应体积的Cystatin溶液，并用Cystatin代替所有对照管Papain溶液，之后加入超纯水使整个反应体系为1mL。混合后37 ℃水浴。取50 μL各时间点反应混合物，加热灭酶，留作小肽电泳检测，剩余的混合液微滤除菌后用作滤纸片检测。

1.3.2 Tricine-SDS-PAGE检测Papain酶解程度

将Papain酶解后取样,通过小肽电泳鉴定其酶解程度。同时与Papain和蛋白原样进行对比，采用Tris-Tricine电泳系统[27]，参考SCHGGER等人[28-29]的方法制备电泳胶，利用连续Tricine-SDS-PAGE测定目的蛋白分子质量。根据电泳图确定Cystatin完成酶解所需的时间。

1.3.3 鲢鱼重组Cystatin及其酶解物的抑菌效果比较

采用滤纸片法[30]鉴定Cystatin酶解各时间点的酶解物的抑菌效果，以确定酶解的最佳时间。将草莓假单胞菌、腐败希瓦氏菌和中间气单胞菌菌株分别接种于LB液体培养基中培养，当OD600 nm≈0.6时吸取100 μL菌悬液均匀涂布于直径为60 mm的已加入培养基的平板表面，贴上直径为6 mm的无菌滤纸，向每片滤纸片上添加15、20、25、30 μL的Cystatin/Cystatin酶解物；同时以无菌水/Papain为对照。将平板于30 ℃恒温培养16～18 h，观察测定抑菌圈的大小以判断鲢鱼重组Cystatin的抑菌效果。

1.3.4 凝胶过滤高效液相色谱(TSK-GEL G2000SWXLHPLC)鉴定

参考刘玲[5]的方法鉴定待测样品的纯度和分子质量。以标品蓝葡聚糖-2000测定TSK-GEL G2000SWXL的空体积V0，分别以Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(0.573 ku)、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met(1.046 ku)、乳链菌肽(3.35 ku)、细胞色素C(13.0 ku)、胰蛋白酶(23.3 ku)、胃蛋白酶原(43.0 ku)、牛血清白蛋白(66.0 ku)、γ-球蛋白(150.0 ku)标准蛋白作为标品，相同条件下进行色谱分析，求得各标品的洗脱体积Ve。以Ve/V0值作为纵坐标，标准蛋白分子质量对数为横坐标，绘制TSK-GEL G2000SWXLHPLC的标准曲线，得到回归方程为:y=-0.426 9x+3.399 1，R2=0.977 1。

其中色谱条件：色谱柱为TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.80 mm，5 μm)，流动相洗脱液为100 mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.1 mol/L Na2SO4和7.69 mmol/L NaN3)，流速为0.5 mL/min，进样量100 μm，检测波长280 nm。

1.3.5 双向电泳鉴定目的抑菌片段的分子质量和等电点

双向电泳分为第一向等电聚焦和第二向SDS-PAGE电泳2个部分，具体操作步骤参考王任[31]的方法，以测定目的抑菌片段的分子质量和等电点。

1.3.6 RPLC-MS/MS串联质谱分析

参考刘玲[5]的方法鉴定目的抑菌片段的抑菌序列。将目的蛋白样品进行酶解，冻干之后的肽段用含5%ACN和0.1%FA的溶液充分溶解，离心(17 000g，15 min)后，取上清以3 μL/min流速自动进样通过Eksigent 1D plus高效液相色谱系统，进入C18捕捉柱，调至流速为300 μL/min洗脱至C18分析柱(100 mm×75 μm，柱料1.9 μm)。用30%A液(95%ACN和0.1%FA)洗脱20 min后线性梯度洗脱5 min至80%B液，并在80%B液处保持5 min的洗脱。洗脱的肽段通过纳升电喷雾离子化进入串联质谱TripleTOF 5600(Applied Biosystem，USA)中。MS扫描范围(m/z)350～1 250，累积时间0.25 s，MS/MS扫描范围(m/z)100～1 500，扫描模式：HS高灵敏度模式，累积时间0.05 s，IDA采集模式，1个MS1图谱选择20个最强离子进行串级扫描。

1.3.7 数据分析

采用SPSS 22.0数学软件进行统计分析，Excel 2010计算各指标的平均值和标准差，采用One-Way ANOVA法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE鉴定酶解物

鉴定结果如图1所示。Cystatin与Papain于37 ℃反应0、6、12、18、24 h时，Papain都能将Cystatin彻底水解成分子质量不同的肽段。但明确该最适酶解时间还需要结合滤纸片实验，进一步鉴定各时段酶解物的抑菌效果。

M-Marker标准蛋白(9.5～66.0 ku); 1-Papain;2-Papain酶解鲢鱼Cystatin 0 h；3-Papain酶解鲢鱼Cystatin 6 h;4-Papain酶解鲢鱼Cystatin 12 h; 5-Papain酶解鲢鱼Cystatin 18 h;6-Papain酶解鲢鱼 Cystatin 24 h
图1 Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定酶解产物
Fig.1 The product was identified by Tricine-SDS-PAGE

2.2 滤纸片法鉴定Cystatin及其酶解产物的抑菌效果

采用滤纸片法鉴定Cystatin酶解各时间点的酶解物对3种优势腐败菌(草莓假单胞菌、腐败希瓦氏菌和中间气单胞菌)的抑制效果如表1所示。结果表明，Cystatin酶解0、6、12 h的酶解物对其均有抑菌效果，而Cystatin酶解18 h和24 h后的酶解物没有抑菌活性。综上实验结果表明，Cystatin及其酶解物对3种优势腐败菌的抑菌圈直径大小呈现出Cystatin 6 h酶解物>Cystatin 12 h酶解物>Cystatin原样。结合Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定结果，可以确定Papain酶解Cystatin的最适条件为：Cystatin与Papain按m(Cystatin)∶m(Papain)=1∶0.25，均匀混合，37 ℃下反应6 h，其对优势腐败菌的抑制作用见图2。

表1 Cystatin不同酶解时间酶解物对腐败菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of cystatin enzyme of differenttime dominant spoilage strains

注：“—”表示没有出现抑菌圈。

a-草莓假单胞菌; b-腐败希瓦氏菌; c-中间气单胞菌;
A-Papain对照; B-Cystatin 15 μL/片; C-Cystatin 20 μL/片; D-Cystatin 25 μL/片; E-Cystatin 30 μL/片
图2 Cystatin 6 h酶解物对优势腐败菌的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effect of cystatin 6 h enzyme on dominant spoilage strains

实验中酶解后的Cystatin较Cystatin原样对3种优势腐败菌的抑菌效果强，可能是由于Cystatin酶解后其内部的抑菌序列暴露出来，增强了抑菌效果。Cystatin酶解6 h的酶解物较Cystatin酶解12 h对3种腐败菌的抑菌效果好，可能是因为不同酶解时间Papain酶解Cystatin的产物不同。由此，推测实验所得的具有抑菌活性的片段很可能是来自Cystatin的降解物，有必要对所得的目的抑菌片段做进一步鉴定。

2.3 目的抑菌片段的分离纯化及抑菌效果

将酶解6 h后的重组Cystatin小肽片段通过TSK-GEL G2000SWXLHPLC进行分段收集，由图3可知，水解后的样在TSK图上形成了4个不同大小的峰型，其保留时间分别为13.0 min(T-1)、21.5 min(T-2)、25.0 min(T-3)、26.0 min(T-4)，分别收集各峰，于-80 ℃冷冻干燥备用。通过滤纸片法鉴定各峰的抑菌活性，发现仅峰T-2对3种腐败菌具有抑菌效果，其结果如图4所示，当Cystatin的加量为15、20、25、30 μL/片时，对草莓假单胞菌抑菌圈直径分别为12、13、15、18 mm；对腐败希瓦氏菌抑菌圈直径分别为16、18、20、21 mm；对中间气单胞菌抑菌圈直径分别为20、22、29、33 mm。

图3 Papain酶解重组Cystatin蛋白6 h样上TSK-GEL G2000SWXLHPLC
Fig.3 Papain enzymatic hydrolysis of recombinant Cystatin for 6 h and identified by TSK-GEL G2000SWXLHPLC

a-草莓假单胞菌; b-腐败希瓦氏菌; c-中间气单胞菌;
A-Papain对照；B-Cystatin 15 μL/片；C-Cystatin 20 μL/片；D-Cystatin 25 μL/片；E-Cystatin 30 μL/片
图4 TSK回收峰2对优势腐败菌的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effect of TSK peak 2 on dominant spoilage strains

2.4 目的抑菌片段的TSK-GEL G2000SWXLHPLC鉴定

将Cystatin酶解后经TSK-GEL G2000SWXL分离收集的具有抑菌效果的峰T-2的冻干粉复溶后进行检测，结果如图5所示，保留时间为21.5 min，根据峰尖处的Ve/V0值，经标准曲线公式计算其分子质量为8.6 ku，且纯度较高。

图5 TSK gel G2000 SWXLHPLC鉴定目的抑菌片段
Fig.5 TSK gel G2000 SWXLHPLC identification bacteriostatic fragments

2.5 双向电泳鉴定目的抑菌片段

将目的抑菌片段经1 ku超滤杯浓缩后透析除盐，经双向电泳检测，在靠近标准10 ku附近有1条单一条带(如图6)，可知其分子质量为8.6 ku，pI值为6.5，与Cystatin酶解结果基本一致。

图6 目的抑菌片段的双向电泳图谱
Fig.6 2-DE Patterns of antimicrobial fragments

2.6 质谱鉴定目的抑菌片段

质谱产生的文件通过导入Protein Pilot 5.0 software(AB SCIEX)进行鉴定，结果见表2，其质谱图见图7。经质谱分析鉴定到3个肽片段，经UniProt数据库对比后发现这2个肽片段序列与鲢鱼Cystatin氨基酸序列(登记号：KF181446序列)完全相符，分别为31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56以及81NPSIEQVIQ89，并且其中的肽段2肽序列含有Cystatin的特征序列QVAAG，因此，说明其有效抑菌片段来自鲢鱼Cystatin本身酶解后的片段。

表2 目的抑菌片段的质谱鉴定结果Table 2 Identification of bacteriostatic fragments of thetarget

注：1)得分：ProteinPilot软件得分，>1.3即为可信；2)95%覆盖率：可信度大于95%的肽段占整个蛋白的覆盖率；3)95%置信区间：置信区间大于95%的肽段数，一般最好取≥2的肽链，1个也可接受。

a-序列: QQQVAAGMK; b-序列: QSNDAFVR; c-序列: NPSIEQVIQCK
图7 Papain酶解Cystatin抑菌肽片段质谱图
Fig.7 A mass-spectrogram of Bacteriostatic Fragments of Papain enzymatic hydrolysis of recombinant Cystatin

3 讨论

目前，已有大量的研究报道了重组Cystatin具有抑菌作用，如人重组Cystatin 9能抑制土拉杆菌(Francisellatulareusis)的生长[8]，重组苋菜Cystatin可以抑制多种植物病原真菌[32]，以及甘蔗重组Cystatin能抑制里氏木霉(Trichodermareesei)的生长[33]。而关于鱼类Cystatin(家族II)的抑菌作用鲜有报道[22, 34]。

Cystatin作为一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其对细菌的抑制机制，主要涉及以下几个方面。其一是通过抑制细菌分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Proteinase，CP)而发挥抑菌作用[30]。其二可能是Cystatin可穿透细胞膜进入细胞质，扩散到细胞内部抑制其细胞内蛋白酶的水解活性[2]。其三可能是Cystatin的N端与CP相互作用的保守序列，能与细菌生物膜上的负电荷相结合而发挥抑菌作用[35]。其四，Cystatin内部具有的抑菌氨基酸序列，这些抑菌片段可能干扰了微生物的肽转运系统[24]，而与Cystatin抑制CP无关[36-37]。综上可见，Cystatin抑菌也可能是多种机制联合作用的结果。

本实验中，Cystatin经适宜时间(6 h)酶解后的产物，相对于0、12、24 h组，对3种优势腐败菌的抑菌效果最好，因此推测此时具有抑菌活性的片段很可能被完全释放出来。本实验鲢鱼重组Cystatin酶解后分离得到分子质量约为8.6 ku的目的抑菌肽段，而通常Cystatin(家族II)的分子质量通常约为12～14 ku，因此判断其为Cystatin的酶解产物。此外，经质谱鉴定到的3个肽序列，分别位于鲢鱼Cystatin序列中的31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56以及81NPSIEQVIQ89，再次证明该8.6 ku的目的抑菌肽来自于鲢鱼Cystatin的酶解，即鲢鱼Cystatin蛋白内部，存在能够发挥抑菌作用的肽片段。同时，鲢鱼Cystatin的N端起始氨基酸残基至第89个氨基酸残基(Q89)，该片段的分子质量为9.986 ku，这也暗示该8.6 ku片段N端可能遭到了水解破坏，其N端氨基酸并非鲢鱼Cystatin的起始氨基酸，故推测其抑菌机制可能不包括通过N端序列结合菌体而发挥作用的可能性，可能是与其内部序列有关。此外，由于该目的抑菌片段为小分子片段(8.6 ku)，因此可能更容易穿透细胞膜进入细菌内部从而发挥抑制作用。鉴于Cystatin的多种抑菌机制，鲢鱼重组Cystatin及其酶解产物对优势腐败菌的具体抑菌机制，还有待进一步深入探究。