高效液相色谱-串联质谱法测定多种食品和饲料中的胶霉毒素

曹晓琴，张涛，施璐，房辉，陈中强，方振峰

(江汉大学 医学院，湖北 武汉，430056)

烟曲霉是侵袭性曲霉病(inva-siveaspergillosis，IA)最常见的病原菌，可产生多种免疫抑制性真菌毒素。胶霉毒素是烟曲霉产生的真菌毒素之一，是其重要的毒力因子，对人和一些哺乳动物细胞具有免疫抑制及促凋亡作用。关于胶霉毒素的毒害作用，报道主要集中在侵袭性曲霉病患者血清中[1]。周万青等[2]报道在侵袭性曲霉病动物模型和临床确诊患者血清中均可检测到胶霉毒素，预示其可作为曲霉病诊断指标。LEWIS等[3]采用LC-MS/MS方法检测了早期的侵袭性曲霉病人中的胶霉毒素的含量，推测检测胶霉毒素可作为诊断侵袭性曲霉病的一种新型方法。CERQUEIRA等[4]也采用LC-MS/MS方法检测了侵袭性曲霉病人中的胶霉毒素的含量。一些研究发现，食品和饲料中也有可能存在威胁人类和动物健康的胶霉毒素，如KOSALEC等[5]发现胶霉毒素可产生于玉米的贮存过程中，也存在于猪、牛等动物的饲料中。PENA等[6]证实胶霉毒素还存在于空气和灰尘中。所以对食品和饲料中的胶霉毒素进行残留检测很有必要。本文采用加压溶剂萃取技术(pressurized liquid extraction，PLE)结合全自动固相萃取技术(automated solid phase extraction，ASPE)对多种食品和饲料基质进行处理，HPLC-MS/MS检测，建立了多种食品和饲料中胶霉毒素的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

胶霉毒素标准品(纯度≥97%)，购自美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，正己烷、NaOH、HCl(分析纯)，购于国药集团化学试剂有限公司；Oasis HLB柱(60 mg，3 mL),购于美国Waters公司；Mycosep 226真菌毒素净化柱(5 mL),购于奥地利Romer Labs公司；Bond Elut Mycotoxin柱(500 mg，3 mL),购于美国Varian公司。

玉米、小麦、猪饲料(主要成分为玉米、大豆、鱼粉)和鸡饲料(主要成分为玉米、豆粕、麸皮)等样品购于江汉大学农贸市场，样品先粉碎，然后常温保存。猪肌肉和肝脏的样品采购于武汉家乐福超市，样品先绞碎，然后匀浆，-20 ℃冰箱中保存。

1.2 仪器与设备

HPLC-MS/MS中MS/MS部分(API 4500 triple-quadrupole)，美国Applied Biosystems公司;HPLC部分(LC-30AD和SIL-30AC)，日本Shimadzu公司；加压溶剂萃取(PLE)设备(Dionex ASE 200)，美国Sunnyvale公司；全自动固相萃取(ASPE)设备(Gilson Aspec XL4)，英国Anachem公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex 100 RP-18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)(Phenomenex, USA)；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈/0.5%乙酸水溶液(50/50，V/V)，流速：0.2 mL/min；洗脱时间：5 min。

1.3.2 质谱条件

电离方式：ESI源(+)；碰撞气(CAD)：6 psi；气帘气(CUR)：20 psi；雾化气(GS1)：60 psi;辅助气(GS2):55 psi；离子喷雾电压(IS)：5 500 psi；离子源温度(TEM)：550 ℃。胶霉毒素的母离子和子离子条件见表1。

表1 胶霉毒素母离子/子离子信息Table 1 Precursor/daughter ions information of gliotoxin

注：加“*”的离子用于定量。

1.3.3 前处理条件

参考文献[7]、[8]中报道的方法，采用加压溶剂萃取(PLE)设备提取。取玉米、小麦及饲料样品经多功能粉碎机粉碎，猪肌肉和肝脏样品经匀浆后，准确称取试样5.00 g(精确至0.01 g)，放入PLE萃取池中，将加压溶剂萃取仪(PLE)设置为表2的萃取条件后开始萃取，萃取完成后，将萃取液转移到50 mL离心管中，5 000 r/min离心5 min，上清液用氮气[(45±5) ℃]吹干。残渣用乙腈/水(10/90，V/V)3 mL定容，准备ASPE装置净化。

表2PLE设备萃取不同样品中胶霉毒素的条件选择
Table2SelectedPLEoperatingconditionsfromdifferentsamples

提取条件玉米、小麦及饲料猪肌肉和肝脏溶剂乙腈/水(50/50，V/V)乙腈/正己烷(60/40，V/V)萃取压力/psi15002000萃取温度/℃8080静态萃取时间/min58冲洗体积/%6060清洗时间/min12循环次数11萃取池体积/mL1111

参考文献[9]中方法，采用全自动固相萃取(ASPE)装置净化。取经PLE提取的提取液3 mL，置全自动固相萃取(ASPE)装置中。活化、上柱、淋洗和洗脱全部按设定程序自动完成。所用试剂分别为：活化液为甲醇和水各3 mL；淋洗液为甲醇/水(5/95，V/V)5 mL，洗脱液为甲醇/水(85/15，V/V)4 mL。所有程序结束后，收集洗脱液，50 ℃氮气吹干。

最后，所有样品均用乙腈/水(10/90，V/V)1 mL定容，过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS测定。

1.3.4 定量测定

所有采集的样品均采用建立的检测方法进行空白基质的筛选，测定结果为无任何干扰峰的基质作为空白基质，用于样品添加试验。采用基质匹配工作曲线外标法定量。

2 结果与讨论

2.1色谱及质谱条件的选择

色谱条件选择时，本研究参考文献[8]研究结果，选用Kinetex 100 RP-18柱，实现了5 min内分离胶霉毒素。同时试验了不同流动相比例和梯度程序，结果发现，乙腈/0.5%乙酸水溶液(50/50，V/V)作为流动相获得良好的分离(图1)，这与文献[9]报道一致。质谱条件选择时，LEWIS[3]报道采用ESI源下的负离子扫描模式，而本文发现虽然胶霉毒素既可离子化为正离子，又可离子化为负离子，但是当胶霉毒素采用负离子扫描时，空白溶剂中与它同一保留时间处会出峰，对检测存在干扰；而且负离子模式的响应值远远低于正离子模式。所以，本文结合胶霉毒素结构特点，最终选择了ESI源下的正离子扫描模式。在MRM状态下，优化各项参数，得到了最优的二级全扫描质谱图(图1)。

图1 空白玉米样品添加2 μg/kg胶霉毒素的特征离子质量色谱图
Fig.1 LC-ESI-MS/MS chromatograms obtained in positive ion mode of 2 μg/kg gliotoxin

2.2提取条件的选择

对于真菌毒素，甲醇和乙腈是最常用的提取试剂，文献在这方面有大量的报道[12-14]，本研究参考CHEN等[7]依次对PLE的提取溶剂、压力、温度和时间等参数分别进行优化，同时结合文献[9]、[10]、[11]对PLE条件的优化方法，分别对不同的样品进行试验，结果发现，采用乙腈和水的混合液提取玉米、小麦及饲料取得较高的回收率分别为89%、92%和95%，同时基质效应也能满足要求(采用t检验的方法来考察基质效应，t值均小于2.4)。而对于动物性食品，脂肪含量较高，所以本文选用不同比例的乙腈和正己烷作为提取试剂，使提取和去除脂肪一步完成。结果显示，乙腈/正己烷比例为(60/40，V/V)时效果较好(回收率为87%)。此外，实验结果表明乙腈比甲醇更适合做提取试剂，这与文献[9]报道一致。同时根据仪器的适用条件对其他萃取条件分别进行选择，结果发现，不同的样品需要的萃取条件不同，成分复杂的动物性食品需要更高的萃取压力(2 000 psi)，更长的萃取时间(8 min)才能取得最优的效果，具体结果见表2。

2.3固相萃取净化条件的选择

经过提取后的样品一般都要进行进一步的净化才能进入HPLC-MS/MS仪检测。根据文献，真菌毒素的净化柱种类很多[15-21]，文献[15]、[16]采用Bond Elut Mycotoxin柱取得很好的效果，文献[17]比较了Oasis HLB柱，Mycosep 226和228柱，认为Mycosep 226柱回收率最高。而文献[18]认为Oasis HLB SPE柱(200mg, 6cm)柱在净化多种毒素时效果最优。这与本课题组之前的研究结果一致[8]。本文依次以玉米、猪饲料、猪肝脏为研究对象分别试验了Mycosep 226柱、Oasis HLB柱和Bond Elut Mycotoxin柱，经比较实验, 所有基质都选用Oasis HLB柱，猪肝脏的试验结果见图2。

图2 猪肝脏添加胶霉毒素采用3种不同固相萃取柱净化的回收率值
Fig.2 Recovery test of three SPE candidate cartridges in swine liver sample spiked with gliotoxin standard mycotoxins

此外，本方法采用全自动固相萃取技术, 重复性优于传统手动SPE萃取装置，同时，参考文献[22]、[23]、[24]对全自动固相萃取装置各项参数进行优化，结果得出：淋洗液选用甲醇/水(5/95，V/V)5 mL，去杂效果最好，且待测物仍保留。洗脱液选用甲醇/水(85/15，V/V)4 mL时可得到最高的回收率。

2.4基质效应考查

采用t检验的方法来考察基质效应。公式如下：

(1)

式中：a1表示标准曲线的斜率；a2表示基质匹配工作曲线的斜率；es(a1-a2) 表示a1和a2斜率的标准差；α置信度为0.05；若t(n-4)值>2.4，说明存在基质效应。

经过试验，胶霉毒素在玉米、小麦、肌肉和肝脏中的t值分别为4.5、3.2、9.1和12.1。所以，本研究采用基质匹配工作曲线进行定量。对于猪和鸡的不同基质，t检验后无显著差异，所以鸡肝脏和肾脏都采用猪肝脏和肾脏基质匹配工作曲线进行定量。

2.5检出限、定量限及线性范围

在方法学验证中，本研究在文献[25]的基础上，利用配制成的空白样品中按0.2、1.0、2.0、20、50、100 μg/L的水平添加胶霉毒素标准工作液进样检测，绘制标准工作曲线。以峰面积Y对进样质量浓度X进行线性回归，以3倍信噪比确定样品的检出限，以10倍信噪比确定样品的定量限。胶霉毒素在玉米、小麦、猪和鸡的饲料、猪的肌肉和肝脏等样品中线性回归方程、相关系数(R2)、检出限(LOD)及定量限(LOQ)见表3。

2.6准确度和精密度

空白样品按3个水平添加胶霉毒素标准品，每个水平平行测定6次，考察方法的回收率与精密度(表4)，由结果可知胶霉毒素在不同样品中的平均回收率介于81.8%～95.4%，变异系数≤13.2%，满足准确度和精密度的监控要求。

3 结论

本研究利用加压溶剂萃取和全自动固相萃取富集结合高效液相色谱-串联质谱技术，建立了一种可快速、灵敏测定多种食品和饲料中胶霉毒素的方法。通过前处理条件的选择和液相质谱条件的优化，实现了操作的自动化，胶霉毒素在不同样品中的最低检出限在(0.09～0.15) μg/kg，最低定量限在(0.23～0.31) μg/kg。

表3胶霉毒素的线性回归方程、相关系数、检出限及定量限
Table3Regressionequation,correlationcoefficient,limitofdetectionandlimitofquantizationforgliotoxin

样品回归方程相关系数检出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)饲料Y=5．23×104X+3．12×1030．99790．150．22玉米Y=3．41×105X+2．92×1040．99910．130．31小麦Y=2．11×105X+1．92×1040．99870．090．23猪肌肉Y=5．82×104X+4．61×1030．99850．110．27猪肝脏Y=3．81×104X+3．53×1030．99580．120．24

表4不同样品中添加胶霉毒素R及RSD
Table4Therecoveriesandcoefficientsofgliotoxininspikeddifferentmatrixes

样品胶霉毒素添加量/(μg·kg-1)胶霉毒素回收率/%变异系数/%0．381．8±11．912．5饲料0．682．9±10．211．51．283．6±11．213．20．392．1±6．35．3玉米0．694．2±10．211．41．290．2±5．45．90．384．3±9．311．8小麦0．691．5±9．211．81．284．4±10．612．00．393．6±5．65．6肌肉0．695．4±7．78．31．292．3±4．55．60．385．8±6．36．6肝脏0．691．1±12．412．91．287．4±10．310．9

最终该方法各项指标都可满足定量确证要求，可用于食品和饲料中可能存在威胁人类和动物健康的胶霉毒素的痕量监测中。